[发明专利]用于制备闭合线状DNA的体外无细胞方法的试剂盒

权利要求书

1.一种适用于制备闭合线状脱氧核糖核酸的体外无细胞方法的试剂盒，包含至少一种DNA聚合酶和至少一种原核端粒酶。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶是链置换型DNA聚合酶。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶是滚环扩增DNA聚合酶。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶是SEQ ID NO:2的phi29或包含与全长SEQ ID NO:2的至少80％同一性的所述phi29的变异体。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其中，所述原核端粒酶是SEQ ID NO:15的噬菌体N15TelN或包含与全长SEQ ID NO:15的至少80％同一性的所述噬菌体N15TelN的变异体。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，包含dNTP、合适的缓冲剂和一种或多种引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述引物是随机引物。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述引物是特异性引物。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的试剂盒，其中，所述引物包含化学改性的核苷酸。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的试剂盒，包含焦磷酸酶。

11.一种用于体外无细胞制备闭合线状DNA的方法，包括：

-由包含多于一种原核端粒酶靶序列的DNA模板扩增DNA，以及

-使扩增的所述DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件下接触。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，同时或并行进行所述DNA模板的所述扩增和闭合线状DNA的所述制备。

13.包括DNA模板的多个重复的多联体DNA，所述DNA模板包含至少一种原核端粒酶靶序列。

14.根据权利要求13所述的多联体DNA，其中，所述DNA模板包括一种或多种由原核端粒酶靶序列侧接在任一侧的表达盒。

15.根据权利要求14所述的多联体DNA，其中，所述表达盒包含可操作地连接至编码mRNA或蛋白质的序列的真核启动子。

16.根据权利要求14或权利要求15所述的多联体DNA，其中，所述表达盒进一步包含真核转录终止序列。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的多联体DNA，其中，所述表达盒缺失选自由以下组成的组中的一种或多种细菌或载体序列：

(i)细菌的复制起点；

(ii)细菌的选择标记；和

(iii)未甲基化的CpG基序。

18.根据权利要求13至17中任一项所述的多联体DNA，其中，所述多联体DNA包含10个或更多个单位的扩增的DNA模板。

19.根据权利要求13至18中任一项所述的多联体DNA，其中，所述多联体DNA的大小为至少5kb。

20.根据权利要求13至19中任一项所述的多联体DNA，其中，所述多联体DNA是具有模板DNA的多个重复的线状单链DNA。

21.根据权利要求13至20中任一项所述的多联体DNA，其中，所述多联体DNA是在体外。

22.根据权利要求13至21中任一项所述的多联体DNA，其中，所述DNA模板包含多于一种原核端粒酶靶序列。