[发明专利]一种结核分枝杆菌ERP 12基序突变为PGLTS的重组质粒PEGFP-12

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种结核分枝杆菌ERP 12基序突变为PGLTS的重组质粒PEGFP-12。

背景技术

牛结核病是一种慢性消耗性传染病，影响动物的奶、肉以及家畜产品的产出，造成了严重的经济损失。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起牛结核病的主要致病菌，其致病性与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症、菌体成分和代谢物质的毒性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。

Erp(exported repeated protein)，也称为P36，Pirg或Rv3810，是结核分枝杆菌的一种重要毒力因子，erp存在于结核分枝杆菌复合体所有成员(结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡介苗和田鼠分枝杆菌)中，也存在于麻风病致病菌麻风分枝杆菌，但是后来的研究证明，在耻垢分枝杆菌和机会性致病结核分枝杆菌(鸟型分枝杆菌、海分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌和溃疡分枝杆菌)中也检测到了该基因的表达。而在其它的细菌种内没有发现同族体，使得Erp成为结核分枝杆菌家族的一个特异信号分子。

erp全长284个氨基酸，由三个不同的区域组成，N-末端(1-80AA)包含22个氨基酸的信号肽，引导蛋白质在细胞内的运输；中心是基于PGLTS基序的12个重复区，其中前3个基序严格保守；C-末端(176-284AA)包含富含脯氨酸和丙氨酸的疏水性区域。中间重复区具有一定的可变性，其主要体现在两方面。首先，重复区的绝对数是可变的，如麻风分枝杆菌的PGLTS重复区是4、结核分枝杆菌是12、而耻垢分枝杆菌是21。其次，PGLTS重复区的序列是可变的。在一些种间，如耻垢分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌有一半的重复区是错配的。Erp蛋白的N-端、中间重复序列以及C-末端对于蛋白质的功能有很重要的作用，但是具体的分子机制尚属未知，特别是中间的重复序列的PGLTS的保守性与功能的关系目前尚未研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种结核分枝杆菌ERP 12基序突变为PGLTS的重组质粒PEGFP-12，首先合成了中间重复序列完全突变为PGLTS保守序列，并构建其真核表达载体PEGFP-12，并将该载体与ERP野生型载体PEGFP-ERP分别转染人肺泡上皮II型细胞----A549，之后通过蛋白芯片检测转染后细胞相关因子的变化，为研究PGLTS基序突变与功能关系提供有力数据。

其具体技术方案为：

一种结核分枝杆菌ERP 12基序突变为PGLTS的重组质粒PEGFP-12，根据结核分枝杆菌野生型ERP的序列，合成出12基序完全突变为PGLTS的ERP完整序列，并进行人源化优化，构建到PEGFP-N1真核生物表达载体上，并命名为PEGFP-12。突变后的序列如SEQ：ID：NO：1所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明将该载体转化到大肠杆菌中大提质粒，将质粒用脂质体转染法转到A549细胞中，然后做蛋白芯片检测，看转染后与野生型相比，细胞因子变化情况，为研究PGLTS基序突变与功能关系提供有力数据。本发明构建了结核分枝杆菌ERP的12基序突变为PGLTS的基因重组质粒，将质粒用脂质体转染法转到A549细胞中，然后做蛋白芯片检测，并与野生型ERP序列相比较，发现基序完全突变为12个PGLTS之后引起细胞细胞炎性相关因子表达明显上调，说明突变后能够引起更明显的炎性反应，为研究PGLTS基序突变与功能关系提供有力数据。

附图说明

图1是转染pEGFP-Erp-1224hA549细胞(200×)；

图2是转染pEGFP-Erp-1224hA549细胞(200×)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

由上金斯瑞生物科技公司合成出12基序完全突变为PGLTS的ERP完整序列，并进行人源化优化，构建到PEGFP-N1真核生物表达载体上，克隆位点为HindIII/PstI，并命名为PEGFP-12。突变后的序列如SEQ：ID：NO：1所示。

将该载体转化到大肠杆菌中大提质粒，将质粒用脂质体转染法转到A549细胞中，然后做蛋白芯片检测，看转染后与野生型相比，细胞因子变化情况，为研究PGLTS基序突变与功能关系提供有力数据。