[发明专利]一种提高棉花种子DNA提取质量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA提取方法，具体地说，涉及一种提高棉花种子DNA提取质量的方法。

背景技术

基因组DNA提取是分子生物学研究的基础。常用的DNA提取方法主要有十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法、十二烷基硫酸钠(SDS)法。SDS法操作简单，但所得产物含杂质较多；CTAB可破碎细胞壁和细胞膜，并能与核酸形成复合物，进而从富含多酚和多糖的植物组织中分离出高质量基因组DNA。由于不同材料所含的物质成分及各种成分的含量差异较大，因此，对于不同植物基因组DNA提取应采取不同的方法。

由于棉花种子富含蛋白质、棉酚、多糖、单宁等次生代谢物杂质，传统的CTAB法和SDS法对富含杂质的种子的提取效果不佳，所得DNA纯度很低。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种提高棉花种子DNA提取质量的方法。

一种提高棉花种子DNA提取质量的方法，其为在CTAB法或SDS法的提取缓冲液中加入1％Tween-20(即吐温20)(V/V)后进行棉花种子DNA提取。即以CTAB-1％Tween20提取缓冲液替换CTAB法中的CTAB提取缓冲液进行棉花种子DNA提取，或以SDS-1％Tween20提取缓冲液替换SDS法中的SDS提取缓冲液进行棉花种子DNA提取。

其中，所述CTAB-1％Tween20提取缓冲液为：100mmol/L Tris-HCl,20mmol/L EDTA,2％CTAB(W/V),2％PVP40(W/V),8％NaCl(W/V),2％β-巯基乙醇(W/V)，1％Tween-20(V/V)。

其中，所述SDS-1％Tween20提取缓冲液为：1％SDS(W/V),10mmol/L EDTA,8％NaCl(W/V),50mmol/L Tris-HCl,0.5％山梨醇(W/V),1％PVP40(W/V),2％β-巯基乙醇(W/V)，1％Tween-20(V/V)。

以CTAB-1％Tween20提取缓冲液替换CTAB法中的CTAB提取缓冲液进行棉花种子DNA提取的具体步骤如下：

1)将称量好的棉花种子冷冻干燥24h后30Times/s研磨35s，加入经65℃预热的800μl CTAB-1％Tween20提取缓冲液，震荡30s，65℃水浴40分钟；

2)加入800μl的氯仿:异戊醇的体积比为24:1的溶液，混匀10分钟，10000r/min离心10分钟；取上清液加入等体积的氯仿:异戊醇的体积比为24:1的溶液重提一次，10000r/min离心10分钟；

3)取上清液，加入2倍体积经－20℃预冷的无水乙醇，缓慢颠倒15次以上，于-20℃冰浴30分钟以上，然后12000r/min离心7分钟；倾去上清液，用体积百分含量70％的乙醇洗2次，无水乙醇洗一次，风干30分钟至干燥后加入200μl TE缓冲液，4℃保存。

以SDS-1％Tween20提取缓冲液替换SDS法中的SDS提取缓冲液进行棉花种子DNA提取的具体步骤如下：

1)将称量好的棉花种子冷冻干燥24h后30Times/s研磨35s，加入经65℃预热的800μl SDS-1％Tween20提取缓冲液，震荡30s，65℃水浴40分钟；

2)加入800μl的氯仿:异戊醇的体积比为24:1的溶液，混匀10分钟，10000r/min离心10分钟；取上清液加入等体积的氯仿:异戊醇的体积比为24:1的溶液重提一次，10000r/min离心10分钟；

3)取上清液，加入2倍体积经－20℃预冷的异丙醇，缓慢颠倒15次以上，于-20℃冰浴30分钟以上，然后12000r/min离心7分钟，倾去上清液，用体积百分含量70％的乙醇洗2-3次，无水乙醇洗一次，风干30分钟至干燥后加入200μl TE缓冲液，4℃保存。

本发明还提供CTAB-1％Tween20提取缓冲液，其为：100mmol/L Tris-HCl,20mmol/L EDTA,2％CTAB(W/V),2％PVP40(W/V),8％NaCl(W/V),2％β-巯基乙醇(W/V)，1％Tween-20(V/V)。

本发明还提供SDS-1％Tween20提取缓冲液，其为：1％SDS(W/V),10mmol/L EDTA,8％NaCl(W/V),50mmol/L Tris-HCl,0.5％山梨醇(W/V),1％PVP40(W/V),2％β-巯基乙醇(W/V)，1％Tween-20(V/V)。