[发明专利]一种血小板跨膜电位检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及输血医学领域，具体地说，涉及一种血小板跨膜电位检测方法。

背景技术

血小板是血液成分之一，在止血、凝血以及宿主免疫方面发挥着重要作用。血小板没有细胞核，直径约2～3μm。正常血液中血小板的数量大约为150～400×10⁹/L，在体内的最长寿命约为8～10天。

随着输血医学的发展，血小板制品输注已成为临床输血治疗的重要手段，用于预防和缓解血小板减少症或者功能障碍。但临床上常发生因非免疫因素导致的血小板输注无效，如发热、感染、药物、血小板制品的质量等均可能影响血小板输注效果。血小板的形态、活化、代谢以及凋亡与血小板输注的治疗效果存在密切的联系。血小板在采集、储存、输注的过程中受到各种因素刺激产生的储存损伤，导致血小板结构与功能的改变。血小板的储存可能导致血小板部分被活化以及代谢功能的丧失，影响血小板的聚集活性和粘附能力。血小板在体外保存期间的活化损伤即血小板储存损伤决定着血小板制品的质量。正确快速评估血小板储存损伤对于指导采供血机构和临床医疗机构规范操作，规避血小板制品储存损伤，降低血小板输注无效的发生频率，提高输血疗效，节约有限的血液资源来说是十分必要的。

目前评估血小板保存质量的相关检测指标有血小板计数、平均体积、形态学积分、pH、血小板聚集活性、低渗休克率、CD62p和磷酯酰丝氨酸(PS)表达等，主要检测血小板形态学及血小板功能的变化。尚未见对血小板生物电能改变的检测。在正常生理情况下细胞内环境的各种成分和理化性质只在很小的范围内发生变动，即存在一个内环境的稳态。在内、外环境因素的刺激作用下细胞内环境稳态失衡，在此基础上才出现各种病理生理变化。血小板没有细胞核，因而极其脆弱，离体条件下非常容易被破坏。血小板在体外保存过程中由于多种因素在体外容易被活化，这个过程中可能造成血小板内环境生物电能稳态的失衡，表现为血小板跨膜电位的变化。因而跨膜电位的变化是血小板活化损伤的最初、第一步的反应。第一时间观察血小板的生物电能的失衡，即血小板跨膜电位的测量，比其他方法能更及时快速地了解血小板生理变化，及早预判可能的血小板储存损伤，尽早调配血液资源，尽量减少血小板输注无效的发生，提高血小板临床输注安全。血小板膜电位变化的监控可作为目前常用的血小板形态和功能监测方法的一个补充。

目前膜电位检测方法如下：

1.电压钳(Vol tage-clamp)是由英国学者Huxley和Katz最先应用的。其实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化，因此电压钳可用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动。但该技术由于在细胞内插入两根电极，对细胞损伤很大，在小细胞中难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致，而逐渐被膜片钳所取代。

2.膜片钳技术(Patch-clamp)是在电压钳基础上发展起来一种新技术，与电压钳的主要区别有二：一是钳制膜电位的方法不同；二是电位固定的细胞膜面积不同，即所研究的离子通道数目不同。与电压钳一样，膜片钳也是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域(膜片)形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接，从而可反映细胞上单一(或多数)离子通道的分子活动。

3.电压敏感染料也称为荧光探针，按照染料对膜电位变化的反应速度可以分为慢反应电压敏感染料和快反应电压敏感染料。慢反应染料被称为Nernstian染料，对细胞膜有通透性，细胞被染色时，染料可渗入细胞膜双脂质层。当细胞膜超极化时，染料与膜成分相结合，膜表面染料浓度下降，出现消光效应，膜表面荧光减弱；反之，当细胞膜去极化时，染料又重新被释放至膜表面，膜表面染料浓度增加，膜表面荧光增强。在细胞膜两侧电位差的影响下，这些电压敏感荧光染料在胞外染色缓冲液和细胞质之间的分布服从能斯特方程，据此可计算出细胞膜两侧电位差即跨膜电位的大小。