[发明专利]一种血小板跨膜电位检测方法

权利要求书

1.一种血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)血小板原液样品离心，弃上清，洗涤；

b)取部分经步骤a)处理的血小板样品，使用含0.8-5mmol/L氯化钙且氯化钾含量为1-6mmol/L的Hepes-Tyrodes buffer重新悬浮血小板，稀释血小板至5～10×10⁹/L，加入流式管，记为F；另取部分经步骤a)处理的血小板样品，使用氯化钾含量为120-150mmol/L且氯化钠含量为2-20mmol/L的Hepes-Tyrodes buffer重新悬浮血小板，稀释血小板至5～10×10⁹/L，加入流式管，记为F₀；

c)向F₀流式管中加入终浓度为0.1-5μg/L的短菌杆肽溶液，使细胞完全去极化；

d)向F和F₀流式管加入终浓度为10-200nmol/L DiBAC4(3)溶液，轻轻震荡，混匀，暗室室温染色15-60min；

e)流式上机检测；

根据修正后的能斯特方程：V＝E_dye＝-(RT/ZF)*ln(F/F₀)，计算血小板跨膜电位，其中，F₀代表细胞完全去极化时的荧光值，F代表细胞处于静息状态下的荧光值。

2.根据权利要求1所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤d)中DiBAC4(3)终浓度为80-100nmol/L，步骤c)中短菌杆肽终浓度为0.5-2μg/L。

3.根据权利要求2所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤d)中DiBAC4(3)终浓度为100nmol/L，步骤c)中短菌杆肽终浓度为1μg/L。

4.根据权利要求1所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤d)中染色时间为15-22min。

5.根据权利要求4所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤d)中染色时间为20min。

6.根据权利要求1所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钾含量为1-5mmol/L，记为F₀的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钾含量为120-140mmol/L。

7.根据权利要求6所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钾含量为2.7mmol/L，记为F₀的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钾含量为137mmol/L。

8.根据权利要求1所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钙含量为0.8-3mmol/L。

9.根据权利要求8所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的Hepes-Tyrodes buffer中氯化钙含量为1.8mmol/L。

10.根据权利要求1所述的血小板跨膜电位检测方法，其特征在于，所述的氯化钾含量为1-6mmol/L的Hepes-Tyrodes buffer具体含有以下浓度的试剂：137mmol/L氯化钠、2.7mmol/L氯化钾、12mmol/L碳酸氢钠、1mmol/L氯化镁、0.4mmol/L磷酸二氢钠、5.5mmol/L葡萄糖、10mmol/L Hepes，pH为7.4。