[发明专利]一种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌及构建方法和应用

权利要求书

1.一种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌将大肠杆菌野生株BW25113基因组上编码异柠檬酸脱氢酶磷酸酶/激酶的aceK基因删除得到大肠杆菌突变株BWΔaceK，选择厌氧诱导的质粒pET-A，在多克隆位点的NdeI/KpnI酶切位点插入caiBCD片段，得到第一个过表达质粒pEH-caiBCD；将caiT插入到pACYCD的NdeI/XhoI位点，同时将caiF插入到同一pACYCD的Hind III/EcoR I位点，得到第二个过表达质粒pACYCD-caiT-caiF；将两个过表达质粒pEH-caiBCD和pACYCD-caiT-caiF同时转入大肠杆菌突变株BWΔaceK中，获得产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌BWΔaceK/(pEH-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)；

从大肠杆菌野生株BW25113的基因组上扩增caiBCD片段，正向引物序列为：5’-GGGCATATGGATCATCTACCCATGCC-3’；反向引物序列为：5’-ATTGGTACCCAACCGTGAGCTATTACGCC-3’。

2.一种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌选择IPTG诱导的质粒pET28a，在pET28a的插入位点NdeI/XhoI插入caiBCD片段，得到第一个过表达质粒pET28a-caiBCD；将caiF插入到pACYCD的NdeI/XhoI位点，同时将caiT插入到同一pACYCD的Hind III/EcoR I位点，得到第二个过表达质粒pACYCD-caiT-caiF；将两个过表达质粒pET28a-caiBCD和pACYCD-caiT-caiF同时转入大肠杆菌大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，获得产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)/(pET28a-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)。

3.根据权利要求1所述的产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于按以下操作步骤进行：

步骤一：以大肠杆菌野生株BW25113为出发菌株，将基因组上的aceK基因删除，得到大肠杆菌突变株BWΔaceK；步骤二：从大肠杆菌野生株BW25113的基因组上扩增caiBCD片段，引物设计正向为：5’-GGGCATATGGATCATCTACCCATGCC-3’；引物设计反向为：5’-ATTGGTACCCAACCGTGAGCTATTACGCC-3’；从大肠杆菌W3110的基因组上扩出基因caiF和caiT，扩增caiF的正向和反向引物序列分别为：5’-CACGCCCATATGTGTGAAGGATATGTTGAAAAAC-3’和5’-CAGCTCGAGTTAACGACGCATACTCTTTGACAA-3’；扩增caiT的正向和反向引物序列分别为：5’-GGGGAATTCATGAAGAATGAAAAGAGAAAAACGG-3’和5’-GCCAAGCTTTTAATCTTTCCAGTTCTGTTTCGCG-3’；步骤三：选择一个厌氧启动子诱导的质粒pET-A为载体，在多克隆位点的NdeI/KpnI酶切位点插入caiBCD片段，得到过表达质粒pEH-caiBCD；将caiF和caiT分别插入到同一个质粒pACYCD的NdeI/XhoI和EcoRI/HindIII位点，得到过表达质粒pACYCD-caiT-caiF；步骤四：将两个过表达质粒pEH-caiBCD和pACYCD-caiT-caiF同时转入大肠杆菌突变株BWΔaceK中，获得产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌BWΔaceK/(pEH-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)。