[发明专利]一种高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌及构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌及构建方法和应用，属生物工程技术领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是唾液酸的主要成分，其含量占整个唾液酸家族的99％以上，通常以α-糖苷的形式位于非还原性寡聚糖如糖蛋白和糖脂的末端。N-乙酰神经氨酸广泛存在于各种生物体内，发挥着多种生理作用。在人体中主要能提高肠道对维生素及矿物质的吸收、抗病毒和提高婴幼儿神经系统的发育。

N-乙酰神经氨酸以其所具有的的生理功能和特殊的结构，应用于食品、保健品和医药中间体领域。食品和保健品领域主要应用于婴幼儿奶粉的添加，以使婴幼儿奶粉更接近母乳的成分，促进婴儿神经系统的发育。医药中间体领域主要用于抗流感药物扎那米韦合成的前体。

N-乙酰神经氨酸的生产目前主要是通过以N-乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸钠为底物，以高表达神经氨酸醛缩酶和N-乙酰氨基葡糖差向异构酶的基因工程菌催化，通过全细胞或酶催化法而合成。该方法所需的底物N-乙酰氨基葡萄糖成本较高，而且涉及到双酶高表达的大肠杆菌发酵，步骤繁琐，成本较高。发酵法生产唾液酸以其工艺简单，绿色环保而吸引了很多研究者的关注，也开发了不同的菌株用于N-乙酰神经氨酸的合成。发酵法存在的主要问题是目前的菌株N-乙酰神经氨酸产量过低，导致其成本仍然过高，限制了其大规模的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌及构建方法和应用。本发明通过用T7启动子强表达N-乙酰神经氨酸合成所需的neuBC基因，构建新的高产N-乙酰神经氨酸的基因工程大肠杆菌，提高了N-乙酰氨基葡萄糖的产量。

为解决上述技术问题，本发明的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，首先是选择在大肠杆菌中表达编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶编码基因neuC和N-乙酰神经氨酸合成酶编码基因neuB，实现利用葡萄糖合成N-乙酰神经氨酸的目的。为了提高N-乙酰神经氨酸的产量，选择了目前所知表达最强的T7启动子作为上述两个基因表达所需的启动子，详见图1，并敲除了N-乙酰神经氨酸分解代谢基因簇nanATEK，阻断N-乙酰神经氨酸的降解，达到在胞外积累终产物N-乙酰神经氨酸的目的。

所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因neuC和N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB来源于空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank No.AF400048中neuB和neuC基因序列全基因合成，或利用空肠弯曲菌(如菌株ATCC43438)的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述分解N-乙酰神经氨酸的nanATEK基因簇为大肠杆菌自身基因组中所有，包含了四个基因，分别为：N-乙酰神经氨酸醛缩酶编码基因nanA、N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因nanT、N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺异构酶编码基因nanE和N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因nanK，四个基因连在一起，构成一个基因簇nanATEK。

上述高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，具体步骤包括：敲除大肠杆菌BL21(DE3)中的分解N-乙酰神经氨酸的nanATEK基因簇，将neuBC基因克隆到表达载体pET24a上，转入敲除了nanATEK基因簇大肠杆菌BL21(DE3)中，获得高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌。其中，该构建方法，更加具体的步骤包括：

1)敲除大肠杆菌BL21(DE3)中的基因簇nanATEK，获得基因簇nanATEK失活的菌株BL21(DE3)/ΔnanATEK；

2)克隆编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的基因neuBC至表达载体pET24a，以实现该基因的超高表达；

3)将2)中获得的表达载体转化入1)所得的菌株中，获得高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌。

所述高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌于2015年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M2015261，CCTCC NO:M2015261的分类号为：大肠杆菌CASOV－5Escherichia coli CASOV－CASOV-5。

本发明还公开了一种高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌的应用，即利用上述工程菌进行N-乙酰神经氨酸的生产，该生产方法包括步骤：

1)在三角摇瓶的培养基中活化培养高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌种子；