[发明专利]一种高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌及构建方法和应用

权利要求书

1.一种高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：所述工程菌是通过将编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶基因通过T7启动子在大肠杆菌中表达以增强两个酶的活性，同时敲除大肠杆菌中的N-乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的nanATEK基因簇构建而成的重组大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：所述编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的基因导入大肠杆菌高表达，是将这两个基因克隆到表达载体上后，以质粒的方式在大肠杆菌中表达。

3.如权利要求2所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：所述表达载体为pET24a载体或含有T7启动子的载体。

4.如权利要求1所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌为BL21（DE3）菌株或含有来源于λ噬菌体中DE3片段的菌株。

5.如权利要求1所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的基因来源于空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据序列全基因合成，或利用空肠弯曲菌的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用类似手段从其他生物体获得。

6.如权利要求5所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的编码基因在空肠弯曲菌中串联在一起，一起克隆表达或分开克隆表达。

7.如权利要求1所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，其特征在于：所述N-乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的基因包括N-乙酰神经氨酸醛缩酶编码基因nanA、编码N-乙酰神经氨酸转运蛋白nanT、编码N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺异构酶编码基因nanE和编码N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因nanK，四个基因连在一起，构成一个基因簇nanATEK。

8.高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，其特征在于具体步骤包括：敲除大肠杆菌BL21（DE3）中的分解N-乙酰神经氨酸的nanATEK基因簇，将neuBC基因克隆到表达载体pET24a上，转入敲除了nanATEK基因簇大肠杆菌BL21（DE3）中，获得高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌。

9.根据权利要求8所述的高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，其特征在于：1）敲除大肠杆菌BL21（DE3）中的基因簇nanATEK，获得基因簇nanATEK失活的菌株BL21（DE3）/ΔnanATEK；

2）克隆编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的基因neuBC至表达载体pET24a，以实现该基因的超高表达；

3）将2）中获得的表达载体转化入1）所得的菌株中，获得高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌。

10.一种如权利要求1所述的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌的应用，其特征在于：利用高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌进行N-乙酰神经氨酸的生产，其步骤包括：

1）在三角摇瓶的培养基中活化培养高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌种子；

2）将培养好的高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌种子逐级放大，并在相应含有发酵培养基的发酵罐中进行好气培养；

3）培养至菌体浓度OD₆₀₀为20~25时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，诱导相关蛋白的表达；

4）至产物浓度不再增加，结束发酵工作;

5) 使用该方法发酵该高产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌可得发酵液中N-乙酰神经氨酸产量在70g/L以上。