[发明专利]一种扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法。

背景技术

高顶鳞皮蚌（Lepidodesma languilati）为蚌科鳞皮蚌属的动物，俗名青壳蚌、美带蚌、狗脑壳，是中国的特有物种。分布于安徽、浙江、江苏、江西、湖北、湖南等地，一般生活于水流较缓、水位较深、无水草的湖泊以及河流的污泥底或泥沙底里。近几十年来，全球范围内淡水贝类种群呈明显衰退趋势，原因是多方面的，由于极端气候的影响，河流湖泊水位急剧下降导致淡水蚌类的栖息地丧失；但人为干扰是造成其多样性减少和群落结构变化的主要因素。无序的水利工程建设、采砂作业导致淡水蚌类栖息地的丧失、寄主鱼类洄游的阻挡和寄主鱼产卵场的破坏；破坏性的捕捞鱼类使寄主鱼种类数量锐减，影响了蚌类生活史的寄生环节；因纽扣珠核制造的需要大量捕捞淡水蚌类，破坏了淡水蚌类的种群结构。以上种种原因导致了淡水蚌类的种群数量、种群密度急剧下降，物种多样性受到严重威胁。本发明首次报道了高顶鳞皮蚌的线粒体基因组，也是首次报道了一种扩增高顶鳞皮蚌线粒体基因组序列的方法，可以为蚌科的线粒体基因组学研究和种质资源保护提供重要的基础材料。

线粒体基因组DNA是裸露的双链超螺旋共价闭合环状分子，少数为线状分子(如原生动物草履虫与四膜虫的mtDNA)，是真核细胞的第二遗传信息系统，或称核外基因及其表达体系。相对于核DNA，mtDNA具有分子量小、多态性高、结构简单、碱基突变率高、母系遗传、进化速度快等特点，已被广泛应用于生理病理、临床诊断、遗传变异、分子标记、系统进化等多方面的研究，与线粒体和线粒体基因组相关的研究已成为临床医学、进化生物学、基因组学、生物信息学等生命科学领域的研究热点和前沿。

蚌科动物线粒体的遗传不单单是母系遗传，还存在线粒体基因组遗传的一种特例——双单亲遗传现象（Doubly-Uniparental  Inheritance,  DUI）。这种遗传方式使后代中雌性mtDN只来自母系（female-transmitted, F type），与严格的母系遗传相似；而雄性的mtDNA 来自双亲，在体细胞中存在F型mtDNA，在精巢中存在父系mtDNA（male-transmitted, M type）。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速扩增高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列的方法。为了实现上述目的，本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现。

本发明所述方法包括下列步骤：

（1）提取蚌的总DNA；使用购自天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，提取高顶鳞皮蚌的总DNA；

（2）利用保守引物分别对cox1、16SrRNA和nad1基因进行普通PCR扩增并测序；

（3）根据测序结果设计长片段引物进行LA-PCR扩增并测序；

（4）序列拼接；

（5）基因注释。

所述的长片段引物包括以下三对：

FG16S-ND1P1：TTGGGGCAATCTTGGAAC

FG16S-ND1P2：CTGCGAAATCAAATGGAGC

FGND1-CO1P1： TTGCCCCGTTACCGTTAT

FGND1-CO1P2：TTTGTTGGTTGCTGCCCT

FGCO1-16SP1： GCTACATTCCCAGACAACG

FGCO1-16SP2:  TGCCCCAATCAAACCTTAT。

本发明的有益效果：通过设计的特异性长片段引物，通过LA-PCR技术对高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组进行扩增，再进行测序、拼接和校正，获得了高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组全序列。本发明获得的高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组序列总长15754bp，可从组成和结构的角度对高顶鳞皮蚌F型线粒体基因组进行分析，可以丰富蚌科线粒体基因组信息，为蚌类的系统发育、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定重要的分子遗传学理论基础。

附图说明

图1为高顶鳞皮蚌总DNA的琼脂糖电泳结果示意图，图中M为DL5000 marker,1、2为高顶鳞皮蚌总DNA；

图2为高顶鳞皮蚌普通PCR扩增的琼脂糖电泳结果示意图，图中M为DL5000 marker,1为保守引物16SrRNA的扩增结果，2为保守引物ND1的扩增结果，3为保守引物COX1的扩增结果；