[发明专利]一种人类羊膜上皮细胞的分离方法

说明书

本发明涉及一种人类羊膜上皮细胞的分离方法，包括以下步骤：第一步，采集运输胎盘；第二步，撕取羊膜；第三步，冲洗羊膜；第四步，剪裁羊膜；第五步，消化羊膜上皮面；第六步，终止消化；第七步，离心收集细胞；第八步，羊膜上皮细胞重悬并接种培养。本发明能分离得到高纯度的羊膜上皮细胞，且细胞数量多、活性高，为羊膜上皮细胞的研究和临床应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及细胞分离方法，具体涉及一种人类羊膜上皮细胞的分离方法。

背景技术

羊膜是胚胎发育的产物，是一层光滑、无血管和神经的半透明薄膜，其内侧包绕胚胎，外与绒毛膜相延续，其厚度70～180 um，具有较高的韧性。作为胎盘的一部分，羊膜为胎儿提供可调节的符合局部运动的空间和适宜环境，通过滤过和物理缓冲作用，分泌营养因子，保持羊水中水和电解质平衡，抑制母体对胚胎的免疫反应等方式保护发生中的胚胎。

羊膜上皮细胞起源于受精后第8天的上胚层细胞(epiblast)，与最终发育成胎儿的起源相同，并且在发育的时间上早于原肠胚形成，因此理论上讲羊膜上皮细胞更好地保持前原肠胚细胞的可塑性 ，具有类似胚胎干细胞的生物学特性，其分化能力强，可向三个胚层分化，并且无致瘤性及伦理学问题。且羊膜上皮不表达人类白细胞抗原HLA-I及HLA-，无异体免疫排斥反应^[7]，因此适合用于细胞治疗。

目前广泛使用的酶解法将羊膜剪碎或者剪成小块利用胰蛋白酶进行消化，并将消化产物直接培养获得羊膜上皮细胞。如CN 104371971 A公开 “一种分离获得羊膜上皮细胞的方法”，将羊膜组织加入胶原酶溶液孵育；然后将羊膜组织加入胰蛋白酶溶液进行消化；将上清液离心后获得羊膜上皮细胞。这种方法会将羊膜上的其他细胞一同分离下来，比如说羊膜间充质干细胞，从而导致细胞不纯，需要进一步纯化。从而导致分离步骤繁琐成功率低。采用酶解法分离羊膜上皮细胞细胞没有统一的标准，分离出来的细胞普遍存在活性差、细胞数量不够、细胞纯度不高、羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞混杂生长的情况。而由于两种细胞的生长特性的差异，混杂培养后由于羊膜间充质细胞分裂能力比羊膜上皮细胞强，多次传代培养后，最终因竞争不过而导致羊膜上皮细胞越来越少直至消失。这样就很难保证有足够的数量和纯度的羊膜上皮细胞用于研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种人类羊膜上皮细胞的分离方法，能分离得到高纯度的羊膜上皮细胞，且细胞数量多、活性高，为羊膜上皮细胞的研究和临床应用奠定基础。

本发明所述的一种人类羊膜上皮细胞的分离方法，包括以下步骤：

第一步，采集运输胎盘，先将采集到的新鲜胎盘放入盛有0.9%质量浓度生理盐水的无菌塑料袋中，密封后放入保护盒中；再将保护盒放入温度为2℃～8℃的运输箱中，并在12小时内运输到细胞分离室；此过程保证了胎盘组织的新鲜及羊膜上皮细胞的活性，为接下来的分离培养分离提供质量保证。

第二步，撕取羊膜，细胞分离人员将接收到的新鲜胎盘放置在圆盘中，先用生理盐水冲洗新鲜胎盘表面，再从新鲜胎盘上完整的撕下羊膜；

第三步，冲洗羊膜，先将撕下的羊膜放入肾形盘中展开冲洗，并用止血钳去除羊膜上的血丝，再用生理盐水反复冲洗至少5次，直至羊膜干净；

第四步，剪裁羊膜，先将冲洗干净的羊膜剪裁成圆形，圆形直径大小较相应培养皿直径大3～4cm，将圆形的羊膜上皮面朝上覆盖于培养皿上，并且圆形的羊膜边缘必须在培养皿边缘之上；这样操作为了确保在接下来的消化过程中胰蛋白酶只单独接触羊膜上皮面。

第五步，消化羊膜上皮面，将0.25%质量浓度的胰蛋白酶液加入到覆盖有羊膜的培养皿中，直至胰蛋白酶液接近装满培养皿，在使羊膜上皮面充分接触胰蛋白酶同时，羊膜的其他部位接触不到胰蛋白酶；在37℃恒温静止消化40～80分钟；消化时间的长短因不同个体羊膜的厚度、面积等不同而有所变化。