[发明专利]检测过氧化亚硝基的荧光探针及制备和应用

说明书

技术领域

本发明属生物检测领域，涉及一类检测过氧化亚硝基的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

过氧化亚硝基是活性氮家族的一员，是生物体内硝化应激反应的产物之一，在体内由一氧化氮自由基及超氧阴离子合成。由于其强氧化性及强亲核性，过氧化亚硝基可以与体内众多的生物分子，包括蛋白质、金属酶、脂质、核酸等反应，引起机体氧化损伤最终导致细胞凋亡。事实上，目前过氧化亚硝基被广泛认为是一氧化氮自由基及超氧阴离子产生细胞毒性的罪魁祸首，并参与心血管疾病、神经退行性疾病等疾病的发生发展。而另一方面，过氧化亚硝基也被报导可作为信号分子或细胞毒效应子清除体内入侵病原体，从而发挥积极的机体保护作用。近期研究表明，过氧化亚硝基可通过硝化蛋白质酪氨酸残基而参与到酪氨酸磷酸化信号通路中。目前，人们对过氧化亚硝基在生物体内的生理及病理角色仍充满争议。因此，发展能对生物体内的过氧化亚硝基进行实时追踪检测的方法，可极大推动过氧化亚硝基相关的生理病理学研究。

传统的检测过氧化亚硝基的方法基本依赖于其下游反应产物——3-硝基酪氨酸的检测。这种检测方法存在特异性差、不能适用于活体检测等两方面的问题。荧光探针检测法是近几年来发展起来的新方法。该方法利用过氧化亚硝基的氧化性或亲核性，设计可与过氧化亚硝基特异性反应的荧光探针，这些荧光探针本身无荧光，与过氧化亚硝基反应后可生成具有强荧光的产物，因而可用于过氧化亚硝基的灵敏检测。由于小分子荧光探针具有体积小、生物膜通透性良好的优点，因而荧光探针法除适用于检测血浆、组织匀浆中的过氧化亚硝基，还适用于活细胞甚至是动物组织中过氧化亚硝基的检测。

发明内容

本发明的一个目的是提供一类新型的特异性检测过氧化亚硝基的小分子荧光探针，具有式Ia或Ib所示的结构通式：

其中：

X为硫或氧原子；

Y为氧原子，或者烷胺基、芳胺基；

R₁为羟基、烷基仲胺或芳基仲胺；

R₂为氢，氟原子或溴原子、C₁-C₄烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基等；

R₃为氢或烷氧基；

R₄为氢、C₁-C₄烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基等；

本发明的又一个目的是提供式Ia及Ib所示化合物的制备方法，通过以下两种制备方法实现：

（1）式Ia化合物的制备方法：

R₄基取代的邻氨基苯硫酚或者R₄取代的邻氨基苯酚与R₁、R₂取代的苯甲醛在甲醇溶液中室温搅拌两个小时，抽滤，即得式1a。

（2）式Ib化合物的制备方法：

A. R₄基取代的邻氨基苯硫酚或者R₄取代的邻氨基苯酚与R₂取代的邻羟基苯甲醛在甲醇溶液，双氧水及盐酸共同存在的条件下室温反应得中间体II；

B. 中间体II在二氯甲烷溶液中，吡啶存在的条件下与三氟甲磺酸酐反应，得中间体III；

C. 中间体III与R₃取代的对羟基苯叔丁基二甲基硅醚或者R₃取代的对氨基苯叔丁基二甲基硅醚在醋酸钯存在下偶联， 后经苯胺氮原子甲基化、羟基脱除硅醚保护基，得Ib所示探针。

其中：

X为硫或氧原子；

Y为氧原子，或者烷胺基、芳胺基；

R₁为羟基、烷基仲胺或芳基仲胺；

R₂为氢，氟原子或溴原子、C₁-C₄烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基等；

R₃为氢或烷氧基；

R₄为氢、C₁-C₄烷基，或者供电性基团如烷氧基、烷胺基等。