[发明专利]一种共表达口蹄疫病毒VP1基因与免疫佐剂牛IL-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种共表达口蹄疫病毒VP1基因与免疫佐剂牛IL‑6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明对乳酸杆菌信号肽的结构进行改造，将改造的乳酸杆菌信号肽基因借一连接短肽GSGGSGG与口蹄疫病毒VP1基因进行连接，连接后的基因序列再与免疫佐剂牛IL‑6基因序列进行融合，融合后的基因序列插入大肠杆菌‑乳酸菌穿梭表达载体中，构建重组质粒pSIP/Asia1/VP1/IL‑6，将pSIP/Asia1/VP1/IL‑6重组质粒转化至乳酸杆菌。本发明针对重组乳酸杆菌表达系统，适当改造信号肽结构以提高乳酸杆菌中外源蛋白的分泌效率，通过黏膜免疫途径免疫实验动物，研究该疫苗的黏膜免疫情况，为研发新型口蹄疫黏膜免疫疫苗提供实验基础。

技术领域

本发明涉及一种重组乳酸杆菌及其制备方法和应用，特别涉及一种共表达口蹄疫病毒VP1基因与免疫佐剂牛IL-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

黏膜免疫系统是一种局部免疫系统，主要由局部黏膜组织及免疫活性细胞组成。黏膜免疫即黏膜免疫系统在病原体等抗原的刺激下，诱导的免疫应答反应。机体与外界抗原接触机会最多，面积最广的就是机体的黏膜表面，因此，黏膜免疫系统是机体的第一道免疫屏障。口蹄疫引起的黏膜免疫主要特征是在感染早期就产生分泌型IgA，在口蹄疫病毒感染最初的几天内，机体尚不能产生特异性的体液免疫反应，此时机体的主要保护能力就是黏膜免疫系统分泌的sIgA以及起屏障作用的上皮细胞和内皮细胞，机体是发病还是隐性感染很大程度上取决于黏膜免疫保护能力的高低。由于口蹄疫可通过呼吸道传播，因而研究黏膜免疫对于预防口蹄疫有潜在的重要意义。

研究者对猪进行试验，发现免疫后的猪在与自然毒接触时，IgA含量高的猪实验组有较好的保护率(Eble,etal,2007)。有研究报道，构建口蹄疫VP1表达载体，与CTB结合，通过黏膜免疫途径免疫猪和小鼠，结果发现，黏膜免疫能够诱导产生IgA，试验猪感染半数致死量的毒，发现保护率可以达到80％(Song,etal,2005)。对于通过消化道和呼吸道感染的传染病而言，黏膜免疫具有重要的意义：能够诱导局部黏膜免疫应答的发生和sIgA的分泌，在入侵和感染部位抵抗病原菌，同时也能诱导体液免疫和细胞免疫。研究表明，黏膜免疫应答产生的抗体比血清中的抗体出现的时间早，持续时间长，在预防和抵抗病原微生物方面起到非常重要的作用。

黏膜免疫的研究发展，使活菌载体疫苗成为疫苗研究中的热点。活细菌载体疫苗能在黏膜表层诱导黏膜免疫应答的发生，刺激sIgA的产生，将病原菌阻挡在体外。乳酸菌作为机体内的正常菌群，能长期的定植于机体内发挥其促进营养物质分子降解和吸收、维持肠道内菌落平衡、调节免疫系统作用等益生作用和免疫佐剂作用，这使得其成为细菌活载体疫苗研究中载体的有力候选菌株。近年来，随着分子生物学的发展和对乳酸菌认识的加深，乳酸菌用于活载体疫苗的研究取得很大进展。乳酸菌表达系统已经成功用于猪流行性腹泻、新城疫、破伤风、轮状病毒等活载体疫苗的研究。

Akinobu Kajikawa等构建了两株重组嗜酸乳杆菌，通过不同锚定结构，来展示沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)。其中一个例子，沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)融合到细胞被膜蛋白酶的C-末端区域，静电结合到细胞壁。另一个例子中，沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)与与粘液结合蛋白的锚定区共轭连接，通过LPXTG结构域与细胞壁连接。这两种重组乳酸杆菌的菌体表面展示方式导致了髓样树突状细胞的不同成熟情况以及髓样树突状细胞的细胞因子分泌。表面展示的抗原对模拟的胃和小肠液环境非常敏感。将重组乳酸杆菌与碳酸氢盐缓冲液以及大豆胰酶抑制剂混合，细胞壁表面抗原可以抵抗体外胃环境模拟实验时的酶解作用。保护试剂的使用可以提高乳酸杆菌在模模拟消化液的生存能力。这些结果证明了在口服黏膜免疫的过程中，保护菌体及其表面展示抗原的重要性。