[发明专利]一种共表达口蹄疫病毒VP1基因与免疫佐剂牛IL-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种共表达口蹄疫病毒VP1基因与免疫佐剂牛IL-6基因的重组乳酸杆菌，其特征在于，所述重组乳酸杆菌含有由在N端引入改造的乳酸杆菌信号肽基因的口蹄疫病毒VP1基因序列与免疫佐剂牛IL-6基因序列连接在一起而得到的融合基因，该融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中改造的乳酸杆菌信号肽基因通过连接短肽GSGGSGG与口蹄疫病毒VP1基因进行连接，连接后的基因序列再与免疫佐剂牛IL-6基因序列进行融合。

2.根据权利要求1所述的重组乳酸杆菌，其特征在于，所述的口蹄疫病毒为Asia1型口蹄疫病毒。

3.一种重组载体pSIP/Asia1/VP1/IL-6，其特征在于，它包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.制备权利要求1或2所述的重组乳酸杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用提高N端正电荷和H区疏水性的方法，对乳酸杆菌信号肽的结构进行改造，将改造的乳酸杆菌信号肽基因通过连接短肽GSGGSGG与口蹄疫病毒VP1基因进行连接，连接后的基因序列再与免疫佐剂牛IL-6基因序列进行融合，融合后的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；

(2)将融合后的基因序列插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体中，构建重组质粒pSIP/Asia1/VP1/IL-6；

(3)将pSIP/Asia1/VP1/IL-6重组质粒转化至乳酸杆菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)将重组质粒pSIP/Asia1/VP1/IL-6电转化导入到乳酸杆菌NC8中，电转化后的乳酸杆菌NC8涂布于MRS培养基上，在37℃培养箱中培养24h-72h，将平板上的菌落挑斑后分别于MRS液体培养基中过夜培养，将过夜培养后的菌液以1:100的接种率接种于50mL MRS液体培养基中，37℃培养至OD值为0.6-0.8，并以浓度为50-100ng/mL乳杆菌肽SppIP为诱导物，诱导表达4-7h得到重组蛋白。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用反转录PCR方法扩增牛IL-6基因，所用引物序列为：

上游引物：5’-AAGCTTATGAATTCTAGATTTACTTCCGCTTTCACC-3’；

下游引物：5’–CTCGAGCTTCATCCTGATGGCCCTCAACGAG-3’。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电转化的电压参数为2500V，5ms。

8.权利要求1或2所述的重组乳酸杆菌在制备Asia1型口蹄疫黏膜免疫疫苗中的应用。