[发明专利]转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医药分析领域，涉及一种利用高效液相色谱检测转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的方法。

背景技术

转移因子(transter factor，简称TF)又称传输因子，由具有细胞性免疫功能的淋巴细胞产生，作为一种特定的细胞因子参与机体的免疫反应，能提高动物机体细胞免疫功能，促进机体抗感染和防御能力。转移因子属于多肽类物质，是由多核苷酸、多肽及其他成分组成的复合分子。其中小分子肽类物质是转移因子的功能标示物，并作为其主要功效成分。而氨基酸是组成多肽的基本单元，是转移因子的关键质量指标。因此，准确测定转移因子中的游离氨基酸含量对于优化转移因子生产工艺及控制产品质量具有重要的意义。

迄今为止，已有较多关于采用高效液相色谱法对转移因子中游离氨基酸进行检测的报道，但由于转移因子组分复杂，报道的检测方法测定色谱图中，存在相邻组分峰间有较大程度重叠的情况，导致检测结果出现较大偏差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法，其能够实现对转移因子中游离氨基酸进行准确定量，显著改善相邻组分峰间的重叠程度。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1)制备供试品溶液；

2)供试品溶液的衍生

精密量取所述供试品溶液2.0mL，并置于10mL具塞试管中；然后向所述具塞试管中加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液0.8～1.0mL以及1mol/L三乙胺乙腈溶液0.4～0.6mL并摇匀，然后于室温下反应1～2小时，反应结束后用正己烷萃取，取萃取得到的下层溶液用滤膜过滤，收集滤液，得衍生后的供试品溶液；

3)测定

精密量取衍生后的供试品溶液，并注入高效液相色谱仪，以0.05～0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液为流动相A，以甲醇、乙腈和水的混合液为流动相B，利用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，记录色谱图，根据标准曲线回归方程求出供试品中游离氨基酸含量，所述梯度洗脱中流动相A与流动相B的体积比为：0min时为97:3，15min时为88:12，20min时为85:15，50min时为50:50，50.1min时为0:100，55min时为0:100，56min时为97:3，70min时为97:3。

所述供试品溶液的制备方法为：精密量取固体转移因子制剂的水溶液、液体转移因子制剂或转移因子溶液并置于量瓶中，加水稀释至刻度后摇匀，得供试品溶液。

所述供试品溶液中多肽的质量浓度为0.4～0.6mg/mL。

所述高效液相色谱仪的色谱柱填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶；所述十八烷基硅烷键合硅胶的粒度为5～10μm，优选5μm；所述色谱柱的内径为2～5mm，优选4.6mm；所述色谱柱的长度为10～30cm，优选25cm。

所述流动相A的pH值为6.0～6.5，优选6.3(用冰醋酸调节pH值)；所述流动相B中甲醇:乙腈:水的体积比为(15～25):(55～65):(15～25)，优选为(20:60:20)。

所述检测方法中，检测波长为210～320nm，优选254nm。

所述检测方法中，进样量为1～50μL，优选2μL。

所述检测方法中，洗脱流速为0.5～2mL/min，优选1mL/min。

所述检测方法中，柱温为20～50℃，优选35℃。

与现有技术相比，本发明的优点至少在于：采用高效液相色谱法测定转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸的含量，通过筛选流动相组成以及梯度洗脱的体积比，使液相色谱图中各氨基酸峰峰形好，分离度高，大大降低了相邻组分峰间的重叠比例，提高了检测准确度，适用于转移因子溶液及其相关制剂中的游离氨基酸的检测，以便对转移因子的生产及其制剂实施有效的监督控制。

通过筛选色谱柱、流动相pH值、色谱柱柱温等措施，进一步确定了最优检测色谱条件，进一步提高了检测准确度，液相色谱图中各氨基酸峰分离度得到提高。

附图说明

图1为本发明实施例中18种氨基酸对照品溶液的液相色谱图。

图2为本发明实施例中转移因子溶液供试品的液相色谱图。

图3为本发明实施例中转移因子口服溶液供试品的液相色谱图。

图4为本发明实施例中转移因子胶囊供试品的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但是，这些实施例仅是用于说明本发明，而不是对本发明范围的限制。