[发明专利]一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶

说明书

本申请是申请号为：201510195795.0，申请日为：2015年04月22日，申请名称为：一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶，属于基因工程领域。

背景技术

腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合作用反应转化为高附加值的酰胺类化合物的金属酶。腈水合酶的结构编码基因包括一个α亚基、一个β亚基和一个调控亚基三个基因。根据活性中心螯合的金属离子的不同，腈水合酶一般可以分为钴型腈水合酶(Co-NHase)和铁型腈水合酶(Fe-NHase)。

腈水合酶在工业生产上已经被广泛应用，其中用这种酶所生产的丙烯酰胺已近百万吨，占整个丙烯酰胺产量的三分之一。生物技术相对于传统的化学合成法有着成本低、能耗少、少污染的优势。然而，在工业生产中，大部分具有高酶活的工业腈水合酶都存在着稳定性差的缺点。例如，来源于Pseudomonas chlororaphilsB23和Rhodococcus sp.N-774的腈水合酶在20℃的条件下保持稳定，而来源于第三代腈水合酶工业生产用菌Rhodococcus rhodochrous J1的腈水合酶也仅仅在10～30℃的条件下稳定。而且由于腈类水合反应是一个放热的过程，所以生产过程中必须通过降温来保持酶活的发挥，因此导致了大量的能耗，提高了生产成本。在工业生产过程中，除了要提高腈水合酶的热稳定性，提高腈水合酶对高浓度产物酰胺的耐受性也是很有必要的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种提高腈水合酶稳定性和耐受性的分子改造方法。由于原始腈水合酶的亚基是分离的，在高温条件下可能会解聚，从而终止酶活。通过分子手段在基因水平上以共价键的方式融合两个亚基，消除了亚基解聚的可能性。从而使得融合型腈水合酶的稳定性提高，更适用于工业生产。该策略具有广泛的通用性，对不同来源的亚基分离的腈水合酶均适用。

本发明的第一个目的是提供一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶。

所述腈水合酶融合表达了β亚基和α亚基并同时表达调控亚基，或者融合表达β亚基、α亚基和调控亚基。

所述腈水合酶，在本发明的一种实施方式中，其基因顺序按照β亚基、α亚基、调控亚基这样的顺序。

所述腈水合酶，在本发明的一种实施方式中，是从来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida NRRL-18668)的序列为SEQ ID NO.1所示的腈水合酶改造得到的。其α亚基、β亚基、调控亚基的氨基酸序列与恶臭假单胞菌的相同。

所述腈水合酶，在本发明的一种实施方式中，其β亚基的氨基酸序列是SEQ ID NO.2，α亚基的氨基酸序列是SEQ ID NO.3，调控亚基的氨基酸序列是SEQ ID NO.4。

所述β亚基和α亚基的基因之间通过核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示的linker连接。

所述腈水合酶，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列是SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的序列。

本发明的第二个目的是提供含有所述腈水合酶的质粒载体。

本发明的第三个目的是提供表达所述腈水合酶的基因工程菌。

所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，是大肠杆菌。

本发明的第四个目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，是将SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列克隆到表达载体pET-28a中，然后转化到Escherichia coli BL21中，即得到基因工程菌。

本发明的第五个目的是提供一种利用所述基因工程菌发酵生产腈水合酶的方法，其特征在于，所述方法是：将重组大肠杆菌接种于含有16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl的培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀＝0.8，然后加入IPTG和CoCl₂·6H₂O进行诱导，诱导温度为24℃，诱导16h。

本发明的第六个目的是提供一种提高腈水合酶比酶活和热稳定性的方法。