[发明专利]一种河豚毒素的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的检测方法。

背景技术

中国鲎主要分布于日本的濑户内海和九州岛北岸，越南、西菲律宾的岛屿，苏门达腊和爪哇岛，马来西亚的北婆罗洲以及加里曼丹东岸等海域，在中国主要分布于长江以南的浙江、福建、广东、广西、海南以及台湾等沿海海域，现以福建、广东、广西、海南为多。圆尾鲎分布于中国香港、北部湾、雷州湾、印度尼西亚爪哇岛北岸以北、菲律宾南部以西和恒河河口印度东北部以东的海域。在我国圆尾鲎主要分布于北部湾、雷州半岛西海岸以及海南的西海岸，近年来发现雷州半岛南海岸及以东沿岸均有圆尾鲎的分布，如湛江、香港等地不少海滩也分布有不少的圆尾鲎。我国人民素有吃鲎的习惯，鲎肉似蟹，只是口感较粗。在中国的广东、广西常有食鲎中毒的事件发生。

河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一种毒性很强的神经性毒素，它最早从河豚鱼中分离出来的。近年来还发现河豚毒素不仅存在于河豚属的鱼类，还存在于虾虎鱼、章鱼、海星、蟹类以及腹足类，甚至还有鲎等众多的海洋生物中。它们不仅本身有较强的毒性而且可以通过食物链富集等途径，污染其他水产品，给人们食用这些水产品构成极大潜在危险。在东南亚河豚毒素中毒已经成为一个难题，一般都是因为摄取了河豚鱼导致的中毒。因为在日本河豚鱼被作为一道佳肴，所以大多数的河豚中毒事件都是发生在日本。另外，误食不明鱼种也是此类中毒事件发生的重要原因，因而加强对水产品中河豚毒素的监测显得尤为必要，多省地方渔业局已将水产品中河豚毒素作为常规检测项目。河豚毒素的检测方法种类繁多，有生物测定法、理化检测方法、免疫化学测定方法等几大类。小鼠法是最常用和最简便的方法，廖永岩等也在2000年用小白鼠法检测了中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素，但此法具有定量不准确且重复性差等缺点。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的方法。

其技术方案如下：

一种中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的检测方法，包括以下步骤：

(1)标准贮备液的配制

精密称量TTX 1.0mg置于5ml离心管中，用1ml移液枪吸取1.0mL的浓度为0.2％醋酸，使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX贮备溶液，置于冰箱中保存；

(2)样品的前处理 

取中国鲎或圆尾鲎待测组织10g，剪碎后加10ml pH＝3.5浓度为0.1％的醋酸于玻璃匀浆器中匀浆，充分匀浆后将样品置于烧瓶中，加50ml浓度为0.1％的醋酸，然后在水浴锅中沸水浴10-20分钟，边加热边搅拌，转速控制在150-200r/min，冷却后用0.45μm滤膜真空抽滤，将滤液放入蒸发皿中，在60-70℃的水浴锅上进行蒸发浓缩，直至10ml，然后过滤定溶至10ml，将浓缩的滤液10ml放在离心管中，经10000r/min的速度，离心15分钟，取上清液经0.22μm的微孔滤膜过滤后，放入干净的离心管中，作为液相色谱待测液；

(3)液相色谱测试 

醋酸流动相色谱条件固定相：SunFire^TMC18色谱柱，直径4.6mm×长度150mm，进样量为20μ；流动相：0.2％醋酸；流速：0.8mL/min；紫外检测波长：210nm；柱温：25℃；每次进样体积为60μL；pH为3.0；

磷酸流动相色谱条件固定相：SunFire^TMC18色谱柱，尺寸为4.6mm×150mm，进样量为20μl；流动相：0.05mol/L NaH₂PO₄-0.05mol/L Na₂HPO₄，pH＝6.8，庚烷磺酸钠离子对5mM；流速：1mL/min；紫外检测波长为200nm；柱温：25℃；每次进样体积为60μL；pH为6.8。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明采用高效液相色谱法检测中国鲎和圆尾鲎体内的的河豚毒素，以便证明鲎体内的毒素到底是不是含有河豚毒素，从而知道是食什么鲎引起食鲎中毒以及含量多少，为食鲎中毒的预防和治疗提供参考。

2、本发明样品前处理步骤中，水浴锅中沸水浴10-20分钟，边加热边搅拌，转速控制在150-200r/min，在这一范围内，物料粘度不会随着搅拌的进行而增大，如果转速过高，粘度增大后转速会逐渐降低会影响河豚毒素的溶出。

附图说明

图1是0.2％的醋酸(pH＝3.0)做流动相的河豚毒素标准样液相色谱图。