[发明专利]一种高效检测纳米颗粒肾毒性的方法

说明书

技术领域

本发明属于纳米颗粒毒性检测领域，具体涉及一种高效检测纳米颗粒肾毒性的方法。

技术背景

随着纳米技术产业化进程，许多纳米材料已经大规模生产并应用于涂料、化妆品、催化剂、新型材料、医学等领域，人们在不知不觉中暴露在有纳米物质存在的环境中。特别是近年来，纳米材料在直接关系到人身安全和健康的医药领域的快速发展，使纳米材料的安全性引起了各方面的格外关注。

纳米材料具有的独特理化性质决定了其独特的生物学效应，诸多研究已表明纳米物质可能具有与常规尺寸物质不同的毒性。

尤其在生物医药领域，纳米颗粒常常用作药物输送的载体，全面快速的检测所用纳米颗粒的毒性，尤其是细胞毒性，显得十分重要。

肾是人体的重要器官，能否精确高效的评价纳米颗粒的肾毒性是判断所用纳米颗粒是否适用于生物医用的重要内容。

在现有技术中，评价纳米细胞的肾毒性的常用方法为进行纳米颗粒毒性的动物实验。然而进行动物实验，所需检测周期长，同时常会由于实验动物的个体差异造成检测误差。现有技术中用于替代动物实验的体外实验，步骤繁琐，容易由于操作失误造成误差，精确度难以保证。

因此，如何实现高效、快捷、高精度的对纳米颗粒肾毒性的检测，成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

    针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高效检测纳米颗粒肾毒性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状包括圆形阵列、椭圆形的一种，圆形半径为100 μm-500μm，椭圆长轴为200 μm-600μm，短轴为100 μm-300μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；

2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备圆形或椭圆形的图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为300-500 nm；

    所述医用高分子聚合物包括聚乳酸、聚己内酯、聚氨酯、聚丙烯腈中的一种，所述有机溶剂包括丙酮、二甲基甲酰胺中的至少一种；

    3）将负性环氧树脂型近紫外线光刻胶SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，保留宽为40-550μm、高为30-80μm的SU-8长方体作为模具，去掉其余的SU-8，；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；

     4）将步骤2）和步骤3）所得物在O₂ 或N₂的氛围下，用等离子体处理30秒，使得步骤2）和步骤3）所得物紧密连接；

    5）将0.5×10⁶-1.5×10⁶个原代肾小管上皮细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.2-0.5 ml/h；再将纳米颗粒悬浮于PBS后泵入,于纳米颗粒泵入后，记录原代肾小管上皮细胞的存活率、细胞形态学、乳酸脱氢酶、谷胱甘肽、丙二醛、超氧化物歧化酶的测定结果、细胞凋亡和周期的变化、细胞内氧自由基、酶活力、特征基因表达水平，得出纳米颗粒的毒性；

所述纳米颗粒包括纳米四氧化三铁、纳米二氧化钛、纳米氧化锌、纳米二氧化硅、纳米银颗粒中的一种。

本发明通过大量的实验摸索发现，当选用直径为300 nm的电纺纤维，并将纤维膜的图案设置为圆形或椭圆形，以及设置PDMS腔体的尺寸为宽为40-550μm、高为30-80μm时，可使得小鼠原代肾小管上皮细胞在腔体内很好的生长，并对纳米颗粒产生几乎与动物实验相同的毒性反应。

本发明可以使得图案化纤维和PDMS腔体和玻璃基底无缝紧密贴合，保证了纳米颗粒完全的与细胞接触，确保了检测的精确度。同时，由于图案化纤维膜紧密的与基底和腔体贴合，使得本发明可以具有很好的重复操作性，节省了检测的成本。

重要的是，任何根据本发明作出的可预计的改变，如微调图案形状和PDMS大小，均属于本发明的保护范围。

特别需要指出的是，本发明适用于检测纳米颗粒的肾毒性。根据本领域的常识，应理解本发明适用于任何纳米颗粒的肾毒性检测。应理解本发明所列举的几种纳米颗粒仅仅用于证明本发明适用于纳米颗粒的肾毒性检测，不应理解为对本发明的限定。