[发明专利]一种促进目标蛋白胞外表达的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种促进目标蛋白胞外表达的方法及其应用，属于生物工程技术领域。是将Bacillus cereus磷脂酶C和目标蛋白(包括胞内定位蛋白和胞外定位蛋白)在大肠杆菌中共表达，可提高胞外定位目标蛋白生产强度，实现胞内定位目标蛋白胞外表达，提高生产效率、简化后提取工艺，具有较高的学术意义和应用价值。

技术领域

本发明涉及一种促进目标蛋白胞外表达的方法及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

基因工程菌表达的重组蛋白的定位方式有两种：胞内定位，在一系列伴侣蛋白的辅助下，合成于核糖体的蛋白定位在细胞基质中；胞外定位，在核糖体中合成后，目的蛋白在自身的功能序列和宿主菌分泌系统的作用下转运至胞外基质。这两种定位方式中，胞外定位不仅有助于蛋白折叠，还有利于降低包涵体的形成量，同时能够避免下游纯化时的破碎细胞等操作，简化纯化步骤、降低成本，减少杂蛋白对产品的污染。因此，胞外定位在工业生产中较胞内定位有优势。

大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统作为目前应用最广泛、研究最透彻的表达系统之一，在培养周期长短、实验操作简便度等方面具有显著优势。天然情况下，大肠杆菌具有I-V型5种蛋白分泌途径，其中研究应用最多的是Ⅰ型和Ⅱ型分泌途径，又以Ⅱ型分泌途径中SecB介导的分泌途径采用较多。通常大肠杆菌中的重组蛋白合成速率是较高的，但是重组蛋白的分泌速率各不相同，很多不能够满足生产需要，因此强化大肠杆菌重组蛋白的分泌效率意义十分重要。

研究表明，Thermobifida fusca角质酶具有磷脂酶B活性，能够水解磷脂酰乙醇胺(PE，大肠杆菌细胞膜磷脂的主要成分)。T.fusca角质酶能够通过破坏大肠杆菌细胞膜使得细胞能够向外进行非特异性渗漏从而达到促进重组蛋白胞外表达的目的。然而，T.fusca角质酶水解磷脂分子的产物之一是溶血磷脂，它有类似表面活性剂的功能，会在发酵过程中诱发大量的泡沫，不利于发酵调控和工业放大。

本发明选取两种重要的工业用酶木聚糖酶和葡萄糖异构酶作为报告蛋白。内切-β-1,4-木聚糖酶可从木聚糖主链内部随机作用于β-1,4-糖苷键，将木聚糖分解成低聚木糖，在食品、饲料、造纸等行业均具有广泛的应用前景。葡萄糖异构酶，又称木糖异构酶，能将葡萄糖、木糖、核糖等醛糖催化异构为相应的酮糖，目前，其主要应用领域为将葡萄糖转化为果糖从而制备果葡糖浆。

发明内容

本发明提供了一种促进重组蛋白胞外表达的方法，是将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的磷脂酶C基因和目标蛋白基因(包括胞内和胞外蛋白)在宿主菌大肠杆菌中共表达，经发酵培养后收集发酵上清液。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将磷脂酶C基因和目标蛋白基因克隆到表达载体上，得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌中得到重组大肠杆菌，重组大肠杆菌发酵培养生产目标蛋白，收集发酵上清液。

所述磷脂酶C基因，在发明的一种实施方式中，来自Bacillus cereus磷脂酶C基因(NCBI编号：CAA45502)。

所述表达载体，在本发明的一种实施方式中，为pETDuet-1、pCOLADuet-1等双启动子载体；pUC系列，pET系列，pT7-7，pGEX等任意一种。

所述重组质粒，在本发明的一种实施方式中，为pET20b(+)-XynA或pET24a(+)-glu。

所述宿主菌，在本发明的一种实施方式中，为E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110、E.coli JM109、E.coli JM109(DE3)或E.coli DH5α等任意一种。其中优选E.coli BL21(DE3)。