[发明专利]一种促进目标蛋白胞外表达的方法及其应用

权利要求书

1.一种促进目标蛋白胞外表达的方法，其特征在于，所述方法是将氨基酸序列为SEQID NO.1所示的磷脂酶C基因和目标蛋白基因在大肠杆菌表达系统中共表达；

所述方法具体是：将磷脂酶C基因和目标蛋白基因克隆到表达载体上，得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌中得到重组大肠杆菌，重组大肠杆菌发酵培养生产目标蛋白，收集发酵上清液；

所述发酵培养具体是：将种子以5-10％的接种量接种，诱导前培养温度为25-37℃，诱导后培养温度25-37℃，pH 6.5-7.5，溶氧20-30％；当发酵初始碳源甘油基本消耗完时，开始流加补料液，所述补料液按指数流加，比生长速率控制在μ＝0.1-0.3h^-1；当菌体干重3-10g·L^-1时，加入5-15g·L^-1甘氨酸；菌体干重15-25g·L^-1时，开始诱导，诱导方法为恒速流加乳糖，乳糖加量0.05-0.5g·L^-1·h^-1，测定菌体干重和培养基中酶活变化，培养基中酶活不再上升时，发酵过程结束。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达质粒为、pCOLADuet-1、pUC系列、pET系列、pT7-7或pGEX中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)、E.coliW3110、E.coli JM109、E.coli JM109(DE3)或E.coli DH5α。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白是天然在细胞内表达的蛋白质或者天然分泌至细胞外的蛋白质。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白为木聚糖酶或葡萄糖异构酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：

(1)获取不含信号肽的磷脂酶C成熟蛋白基因，连接至pMD18-T simple vector，获得质粒pMD18-T-plc；

(2)将pETDuet-1质粒和pMD18-T-plc进行双酶切，连接酶连接过夜后，连接产物转化入E.coli JM109感受态细胞，得到重组质粒pETDuet-1-plc；

(3)将PETDuet-1-plc和含有目标蛋白基因的重组质粒进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，得到含有目标蛋白基因的重组质粒pETDuet-1-plc；

(4)将含有目标蛋白基因的重组质粒pETDuet-1-plc导入宿主大肠杆菌；

(5)发酵培养步骤(4)构建的重组大肠杆菌生产目标蛋白，收集发酵上清液。