[发明专利]一种合浦珠母贝表皮生长因子受体基因Pf-EGFR及其应用

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术技术领域，具体涉及的是一种合浦珠母贝(Pinctada fucata)表皮生长因子受体基因Pf-EGFR及其应用。

背景技术

表皮生长因子受体(Epidermal growth factor，EGFR)是一个分子量为170kDa的多功能跨膜糖蛋白，具有蛋白酪氨酸激酶活性，在与配体结合后发挥生物学效应。目前在多个物种中发现EGFR基因，它不仅参与调节生物机体的信号通路和生长发育，同时在促上皮细胞分裂增殖方面有显著的促生长作用。

合浦珠母贝(Pinctada fucata，简写P.fucata)是生产海水珍珠贝的主要育珠贝，主要分布在我国的广东、广西、海南及台湾沿海地区。合浦珠母贝的育珠产量占全球海水珍珠产量90％以上，是重要的海水经济养殖种类。外套膜与珍珠囊在珍珠的形成中起着重要的作用。目前有关EGFR的研究主要集中在哺乳动物中，在海洋无脊椎动物中的研究非常有限。

发明内容

本发明的目的在于提供一种合浦珠母贝表皮生长因子受体基因Pf-EGFR和由此推断的氨基酸序列。

本发明的目的还在于提供上述合浦珠母贝表皮生长因子受体基因Pf-EGFR在促进合浦珠母贝贝壳和珍珠形成方面的用途。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种合浦珠母贝表皮生长因子受体基因Pf-EGFR，该基因Pf-EGFR的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

该基因Pf-EGFR的cDNA核苷酸序列的154bp～156bp为起始密码子ATG，1168～1170bp为终止密码子TGA，拥有1017bp开放阅读框。

该合浦珠母贝表皮生长因子受体基因Pf-EGFR，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明以合浦珠母贝的外套膜等为材料，首次克隆了合浦珠母贝Pf-EGFR基因的cDNA序列与基因组DNA序列，并通过qRT-PCR技术和原位杂交技术 研究了EGFR在合浦珠母贝的不同组织与不同发育时期的表达情况。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：上述合浦珠母贝表皮生长因子受体基因Pf-EGFR在促进合浦珠母贝贝壳和珍珠形成方面的用途。

本发明具有以下优点：

(1)本发明以合浦珠母贝的外套膜为材料，首次克隆了合浦珠母贝EGFR基因的cDNA序列和氨基酸序列，通过qRT-PCR技术和原位杂交技术研究了EGFR在合浦珠母贝的不同组织与不同发育时期的表达情况；

(2)本发明利用组织原位杂交研究了Pf-EGFR在合浦珠母贝外套膜和珍珠囊中的表达情况，结果显示，强烈的杂交信号出现杂在外套膜的外褶的内表皮细胞与内褶的外表皮细胞，较浅的信号出现在外套膜的中褶。与此同时，在珍珠囊中，杂交信号贯穿整个珍珠囊的表皮细胞与结蹄组织中。这些结果表明，外套膜和珍珠囊中高表达的EGFR在某种程度上可以促进合浦珠母贝贝壳和珍珠的形成。

附图说明

图1是合浦珠母贝Pf-EGFR氨基酸序列同源性比对；

图2是不同物种EGFR氨基酸序列构建的系统进化树(NJ法)；

图3是合浦珠母贝Pf-EGFR在不同组织中的表达情况，其中Mt.外套膜，Ms.闭壳肌，Gi.鳃，He.肝胰腺，Ps.珍珠囊，In.肠，Go.性腺，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)；

图4是合浦珠母贝Pf-EGFR在不同发育时期的表达情况，其中T.担轮期，D.D型期，U.壳顶期，P.眼点期，M.变态期，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)；

图5是Pf-EGFR基因在外套膜组织的原位杂交，其中A、C、D、E是阳性对照，C、D、E是A的放大图像，B是阴性对照，箭头所指深紫色(黑白图中的深色)为阳性杂交信号IF＝内褶，MF＝中褶，OF＝外褶，oe＝外上皮细胞，ie＝内上皮细胞；

图6是Pf-EGFR基因珍珠囊组织的原位杂交，图A、C、D、E、F是阳性对照，图C、D、E、F是A的放大图像，B是阴性对照，箭头所指深紫色(黑白图中的深色)为阳性杂交信号。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1合浦珠母贝表皮生长因子受体基因Pf-EGFR的构建

1.实验样品