[发明专利]一种结核分枝杆菌ESAT‑6蛋白检测试剂盒、制备方法以及使用方法

权利要求书

1.一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌ESAT-6蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由近红外荧光染料标记的单克隆抗体、多克隆抗体包被的纳米磁珠、磁性分离器、蛋白标准品、缓冲液组成；其中，近红外荧光染料标记的单克隆抗体为鼠抗ESAT-6；包被纳米磁珠的多克隆抗体为鼠多抗ESAT-6。建立ESAT-6蛋白标准品梯度浓度和荧光发射值之间的工作曲线，将所测得的发射荧光强度，代入方程即可完成样品中目标蛋白含量的定量(定性)检测。

2.根据权利要求1所述的一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌ESAT-6蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述近红外荧光染料为激发光波长为777nm,发射光波长为790nm的荧光分子，优选NHS活化的近红外荧光染料DyLight800。

3.根据权利要求1所述的一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌ESAT-6蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)制备近红外荧光染料标记的ESAT-6单克隆抗体；

将Dylight800(购自Thermofisher公司)用PBS缓冲液(PH7.4)稀释10倍，取1.4μL与20μg鼠抗ESAT-6单克隆抗体(购自Pierece公司)1mg/ml轻柔混合均匀后于室温避光反应2小时；反应结束后，将标记产物放入透析袋中，4℃，PBS缓冲液透析4小时。标记好的抗体溶液中添加终浓度为1.5％BSA和0.1％Tween20,叠氮化钠0.1‰，4℃保存；使用前将标记产物以PBS稀释2500倍；

(2)制备ESAT-6多克隆抗体包被的纳米磁珠(购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司北京生物技术研究所)；

1)纳米磁珠的预处理：

轻轻混匀磁珠悬浮液，吸取0.01ml悬浮液(25mg/ml)加入1.5ml EP试管中；再加入0.1ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤1次；

加入1ml 0.1M的乙磺酸溶液(pH＝5.0,MES)，重悬磁珠；

2)纳米磁珠的活化

将上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗涤2次，弃上清；

临用前配置终浓度为0.1M的MES，其内含EDC和NHS的浓度均为40g/L(加入上述两种物质后，置于振荡器上充分混匀15分钟，待用)。用该液重悬磁珠；

用磁板吸附磁珠，弃上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，弃上清；

3)磁珠与蛋白的链接；

在已处理好的磁珠中加入50μL ESAT-6多克隆抗体(1mg/ml)(购自Pierece公司)和500μL PBS(PH5.5)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；

用PBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)清洗3次，弃上清；

加入1ml Tris缓冲液(0.1M，0.1％BSA)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；

加入1ml PBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入1ml PBS缓冲液(PH5.5)，弃上清，重复3次。弃上清时，试管需置于磁板上；

加入1ml PBS缓冲液(pH＝7.4，0.05％Tween-20，0.1％BSA，0.05NaN₃)，待用；

(4)制备ESAT-6系列标准品；

ESAT-6(全片段重组蛋白，1mg/ml)(购自杭州启泰生物公司)，PBS(PH7.4)缓冲液稀释至1、5、50、250、1000ng/ml。

4.一种使用权利要求1所述的基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌ESAT-6蛋白检测试剂盒的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)各取50μL各浓度的ESAT-6标准品于EP管中，另取1支EP管加入50μLPBS(PH7.4)缓冲液作为阴性对照；

(2)以上各管加入荧光标记的ESAT-6单抗50μL，37℃反应30分钟；

(3)取完成预处理纳米免疫磁珠100μL，用PBS缓冲液(PH7.4)稀释至1000μL；吸取50μL免疫磁珠，加入所述试管中，37℃反应15分钟，磁板上静置2分钟，弃上清；加入500μLddH₂O，磁板上静置2分钟，弃上清，重复该步骤3次；

所述预处理纳米免疫磁珠的处理方法为：

制备ESAT-6多克隆抗体包被的纳米磁珠(购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司北京生物技术研究所)：

1)纳米磁珠的预处理：

轻轻混匀磁珠悬浮液，吸取0.01ml悬浮液(25mg/ml)加入1.5ml EP试管中；再加入0.1ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤1次；

加入1ml 0.1M的乙磺酸溶液(pH＝5.0,MES)，重悬磁珠；

2)纳米磁珠的活化

将上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗涤2次，弃上清；

临用前配置终浓度为0.1M的MES，其内含EDC和NHS的浓度均为40g/L(加入上述两种物质后，置于振荡器上充分混匀15分钟，待用)。用该液重悬磁珠；

用磁板吸附磁珠，弃上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，弃上清；

3)磁珠与蛋白的链接；

在已处理好的磁珠中加入50μL ESAT-6多克隆抗体(1mg/ml)(Pierece公司)和500μL PBS(PH5.5)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；

用PBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)清洗3次，弃上清；

加入1ml Tris缓冲液(0.1M，0.1％BSA)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；

加入1ml PBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入1ml PBS缓冲液(PH5.5)，弃上清，重复3次。弃上清时，试管需置于磁板上；

加入1ml PBS缓冲液(pH＝7.4，0.05％Tween-20，0.1％BSA，0.05NaN₃)，待用；

(4)各管加入100μL PBS缓冲液(PH7.4)，混匀，用便携式流动进样荧光检测器(为中科院理论物理所制备的样机，该设备固化为激发光波长为777nm，发射光波长为790nm)进行荧光强度测定；

(5)结果判断

定性检测以阴性对照荧光强度值的2倍作为Cutoff值；

定量检测以荧光发射强度和对应的蛋白标准品浓度进行回归分析，建立标准曲线，并拟合方程。