[发明专利]酶的自然变异体的获取方法及超耐热性纤维二糖水解酶

说明书

一种有选择性地获取具有活性的酶的自然变异体的方法，包括1)从由环境微生物菌丛宏基因组DNA碱基序列组成的基因组数据库中，检测具有酶活性的蛋白质ORF序列；2)使用基于该ORF序列而设计的引物，对至少一个环境微生物菌丛宏基因组DNA进行PCR克隆，获得至少一个由该ORF序列的全长、该ORF序列的部分序列、或编码该ORF序列所编码的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残基的氨基酸序列的碱基序列所组成的PCR克隆；3)对在工序2)中得到的各PCR克隆，确定碱基序列及该碱基序列所编码的氨基酸序列；4)测定在工序2)中得到的各PCR克隆所编码的蛋白质的酶活性，选择具有活性的酶的自然变异体。

技术领域

本发明涉及一种酶的自然变异体的获取方法，以及通过该方法获得的超耐热性纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)。

本申请要求2014年3月13日在日本提出的特愿2014-050083号申请的优先权，并将其内容引用在本申请中。

背景技术

在地球上存在有丰富的木质纤维素生物质，人们期待以将其作为原料的乙醇等生物燃料来替代化石燃料成为运输用能源。将木质纤维素转变成乙醇，需要纤维素、半纤维素的糖化。在纤维素糖化中，有硫酸糖化和酶糖化两种方法。通常，基于统称为纤维素酶的糖苷水解酶的糖化与硫酸糖化相比，具有不产生硫酸淤渣、能源投入量少以及不会引起过分解、收率高等优点。

另一方面，构成植物细胞壁的纤维素，其具有相互由坚固的氢键连接的结晶结构，因此几乎不溶于水，基于酶的纤维素水解为固液反应。固液反应是在固体表面上进行结晶性纤维素的水解，因此，基于酶的糖化效率非常低。例如，作为主要的纤维素水解酶的纤维二糖水解酶(CBH)与其它多糖类分解酶相比，水解速度要慢一位数至两位数左右，因此，纤维素生物质的糖化需要大量的酶，这形成纤维素类生物燃料的主要的成本因素。为了降低纤维素乙醇的成本，需要格外提高纤维素酶的糖化效率。

提高酶效率的一种方法为提高酶蛋白质的耐热性。为了提高酶蛋白质的耐热性，人们尝试了随机替换氨基酸序列的定向进化(directed evolution，DE)法、限定特定部位进行氨基酸取代的定点突变(site-directed mutagenesis，SDM)法、将多个基因在多处进行切断并通过改组制成嵌合序列的方法等导入氨基酸变异的各种酶的改良方法。

基于DE法的酶改性在理论上效率极差。其原因在于伴随点突变的数量，变异体的数量呈天文数字级增长，即会产生“组合爆炸问题”。若想得到最适合的氨基酸排列，则需要针对全部氨基酸残基的组合制作突变体库并进行功能检验，这在原理上是不可能的。此外，突变的大部分几乎为丧失功能的功能不全型(loss of function)，获得中立突变或有利的功能的功能获得型(gain of function)十分稀有，基于DE法的最优选氨基酸序列的探索效率差。

由于必须对庞大数量的突变体库进行筛查才能获得有效的突变体、没有有效的高通量(high-throughput)筛查法或稳定基因表达系统等原因(例如，参照非专利文献1。)，该基于DE法的纤维素酶的功能改良无法充分进行。

例如，中泽等提出了将木材腐朽菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的内切葡聚糖酶EGIII通过DE法进行改良的报告(参见非专利文献2)。该EGIII为由218氨基酸残基构成的具有比较小的分子量的蛋白质。但是，即使是这种小的蛋白质，任意一处发生氨基酸取代引起的突变造成的变异体数量为4,360种(20×218)、任意两处突变造成的变异体数量为946万种(20×20×218×217÷2)，更进一步地，任意三处突变造成的变异体数量发生爆炸性组合，为136亿2413万种(20×20×20×(218×217×216÷6))。