[发明专利]一种蛋白质快速荧光标记的方法

说明书

本发明公开了一种对蛋白质进行快速荧光标记的方法，制备GFP帽子探针，利用它能与融合在蛋白质loop上的小肽GFP10‑11通过特异性非共价相互作用结合后产生绿色荧光的性质，实现对蛋白质快速、特异性的荧光标记和定量检测。本发明特异性高，且基本无背景荧光。GFP帽子探针本身基本不能被激发出荧光，只有GFP帽子探针与GFP10‑11特异性结合后才能产生荧光；使用方便；激发波长峰值为482nm左右，发生波长峰值为507nm左右，与绿色荧光蛋白基本一致，可采用常规的荧光显微镜、荧光光谱仪检测。实现荧光标记时间的控制，标记浓度的控制。本发明还能标记细胞表面蛋白，实现对细胞表面蛋白的定量以及示踪，能够用于筛选与细胞表面蛋白内化、多聚化等相关的药物。

技术领域

本发明涉及生物工程技术，具体是一种蛋白质快速荧光标记的方法。

背景技术

活细胞水平上对目的蛋白质的荧光标记是研究目的蛋白质活动和特性的重要手段，GFP(Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)及其衍生物被广泛的应用于活细胞荧光显微成像。通常采取的策略是将全长的GFP融合到目的蛋白质的N-末端或者C-末端，以达到引入荧光标记的目的。但是对于很多特定的蛋白质而言，GFP融合于其中往往会导致其结构和功能遭到破坏或者GFP本身难以正确折叠，从而影响了对目的蛋白的研究。另一方面，通过将全长的GFP融合于目的蛋白引入荧光标记，GFP往往需要一个成熟的过程，这影响了对目的蛋白的实时监测。

Split-GFP是将GFP切开后分别融合于目的蛋白，利用GFP分开部分能自发结合的性质从而引入荧光标记。目前对于split-GFP的应用主要是将超折叠GFP上的末端的一条β-strand(β股)切下，或者借助circular permutation(循环排列)的手段将另外10条β-strand中的一条切下，然后融合表达在所要研究的目标蛋白的C-末端，通过加入体外制备的GFP1-10而引入荧光，以此来尽量的减小荧光标记对所研究系统的干扰。这限制了荧光标记的位置只能是目的蛋白的N-末端或者C-末端。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可在蛋白质任何一个loop(环)区中引入荧光标记的蛋白质快速荧光标记的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种对蛋白质进行快速荧光标记的方法，将一段能与GFP帽子探针特异性结合的小肽GFP10-11融合于目的蛋白的loop区中，融合表达后加入体外制备的可溶的GFP帽子探针，GFP帽子探针即为GFP1-9探针，通过GFP1-9探针与小肽GFP10-11非共价作用特异性结合；结合后产生荧光，从而引入荧光标记，小肽GFP10-11的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。

作为本发明进一步的方案：所述GFP1-9探针的制备方法：GFP1-9探针是由氨基酸序列如序列表中的序列1所示的绿色荧光蛋白经过分子生物学酶酶切而制备得到，酶切后得到的GFP1-9探针的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。

作为本发明进一步的方案：还能用于在细胞表面对蛋白质进行快速荧光标记。

作为本发明进一步的方案：用于细胞表面蛋白的表达水平的定量，用于示踪细胞表面蛋白的内化和多聚化，用于筛选细胞表面蛋白内化和多聚化相关的药物。

作为本发明进一步的方案：所述序列还包括其衍生和/或突变序列。