[发明专利]杂交瘤细胞株Zj/2D8及其检测尼克酰胺‑N‑甲基化酶抗原的应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种蛋白免疫学检测方法，具体涉及一种可以抗尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的细胞株、制备方法及该单克隆抗体的用途。

(二)背景技术

恶性肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病。据世界卫生组织最新数据显示，每年全球癌症新发病例1000多万，死亡700多万，占总死亡人数的12％。到2020年前，每年将新增1500万癌症患者，不仅如此，癌症的死亡人数也在全球迅速上升，2030年这个数字可能会增至1320万。

肿瘤的早期诊断是肿瘤防治的关键，肿瘤的死亡和复发的危险性与初诊时的分期密切相关，且化疗、放疗的敏感性一定程度上取决于癌细胞内的酶或蛋白分子。生物标志物是细胞处于特定条件下代表该细胞生物学状态的重要信号指示分子。为了降低肿瘤的死亡率或提高治疗的效果，许多研究致力于肿瘤关键生物标准物的发现和筛选。因此，寻求肿瘤早期诊断、分期或/和指示化疗、放疗的敏感性、预后以及潜在治疗靶点的肿瘤标志物一直是肿瘤学的研究热点。

尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT，EC2.1.1.1)正常表达于人肝脏组织中，其他组织如肠、肺、肾、胎盘、心脏、骨骼肌、脑、胰腺表达很低或者没有表达。NNMT在不同人的肝脏中活性差异较大，活性的高低取决于胞浆中NNMT的浓度，NNMT的浓度与NNMT的mRNA水平有关，与基因的多态性无关，通常认为NNMT过表达的机制是由于基因翻译后调控异常所致，可能受肝细胞核因子-1(HNF-1)、TGF-β1、STAT3等激活。

NNMT的主要功能是以S-腺苷-L蛋氨酸(SAM)为供体，催化尼克酰胺和吡啶类物质的甲基化，形成吡啶盐，在正常肝细胞中参与药物的生物转化，是催化药物、异型生物质代谢的一种酶。NNMT是维持尼克酰胺平衡的关键酶，所以可以推测NNMT的增高可影响尼克酰胺参与细胞的功能。尼克酰胺是NAD分子的组成部分，可通过补救合成途径生产NAD，而NAD参与细胞的很多基本可能如能力代谢，对应和损伤的抵抗，细胞的寿命等。帕金森综合症被认为与NNMT增高引起的尼克酰胺代谢异常有关，在脑组织中该酶活性过度增高通过两条途径导致帕金森综合症，一是生成神经毒物N-甲基吡啶(如N-甲基-4苯基吡啶(MPP+))激活导致线粒体复合体1受损，二是降低了尼克酰胺导致能量代谢障碍。尼克酰胺还能抑制多聚ADP聚合酶(PARP)，而PRAP通过碱基切除修复、坏死、凋亡等多细胞调节来保持基因组的完整性。因此有理由推测NNMT可能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的发生和发展有关，或可影响化，放疗效果。如能明确NNMT在肿瘤细胞中的作用，并阐明NNMT在肿瘤中的作用机制或分析其下游相关分子组成的模块或通路，必将进一步明确NNMT作为在肿瘤防治中的价值。

近年来，用蛋白助学和基因芯片技术比较不同癌组织和癌旁组织差异时发现NNMT在多种癌组织中异常表达。与正常组织和癌旁组织相比，NNMT在结直肠癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、甲状腺乳头状癌、肾透明细胞癌、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌和胰腺等肿瘤组织有过表达，并在多种肿瘤患者的血清中升高。这些研究提示NNMT与肿瘤发生密切相关，推测NNMT可能参与肿瘤细胞的多种生物功能，与肿瘤的发生和发展有关，或可影响化、放疗效果。

(三)发明内容

本发明采用尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白作为免疫原免疫小鼠制备了能稳定分泌抗NNMT单克隆抗体的细胞株，然后通过NNMT蛋白的间接ELISA法筛选并进一步纯化获得了能分泌NNMT抗体的细胞系及由所属细胞系提取的单克隆抗体，因此本发明目的是提供一株高效分泌抗NNMT(尼克酰胺-N-甲基化酶)抗体的杂交瘤细胞株，利用该细胞株提取NNMT抗体，采用NNMT抗体对待测组织中的NNMT抗原进行检测，进而确定待测组织中NNMT抗原的含量，有助于临床诊断。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株杂交瘤细胞株Zj/2D8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年10月22日，保藏编号为CCTCC NO：C2013149，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编：430072。

本发明还涉及一种所述杂交瘤细胞株Zj/2D8在检测尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT)抗原中的应用，具体所述的应用是提取杂交瘤细胞株Zj/2D8中的NNMT抗体，再根据抗原抗体特异性结合原理，利用NNMT抗体检测待测样品中NNMT抗原含量。