[发明专利]斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因及其编码的蛋白

说明书

技术领域

本发明公开了斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因及其编码的蛋白，属于生物基因技术领域。

背景技术

细胞周期调控是一个精确调控的过程。在细胞分裂过程中真核生物的细胞周期可以概括为两个大的阶段：细胞分裂间期(即G1时期、S时期和G2时期)和细胞分裂期(即M时期)，在细胞分裂时期，需要许多周期蛋白参与调控以保证其精确性。

CDK8是细胞核丝氨酸-苏氨酸激酶，功能是与cyclin C结合，作为DNA结合转录因子和RNA聚合酶II的中介蛋白复合体的重要亚基，参与细胞的转录调节。CDK8与转录起始相关的TFIIH(cyclin H/CDK7/Mat1复合物)、Med12、Med13、RNAPII等相互作用共同调控转录的起始。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族，CDKs的激酶活性取决于结合的细胞周期蛋白(cyclin)和全酶的完整性，cyclin通过与CDKs特异性结合位点的结合调控底物专一性的CDKs的激酶活性，CDKs主要参与调控细胞周期、转录和神经元功能，哺乳动物中报道的CDKs约有20种，包括CDK1-CDK19。其中CDK8作为转录起始过程中重要的调控因子在人的研究中最为广泛和深入，大多集中在肿瘤治疗和细胞信号通路方面。1995年人们在寻找依赖cyclinC的激酶时确认了CDK8，并通过实验证明CDk8在生物体内和体外都能够和cyclin C结合，CDK8作为细胞生长调控的中间信号，之后的实验验证了CDK8在转录调控中的重要作用。近年来CDK8和cyclin C的异常表达经常在各类人类肿瘤中发现，尤其在结肠和直肠癌中的研究较多。CDK8作为中介蛋白复合体的关键组分在转录等过程中的作用机理是当前研究的热点。继人CDk8(Homo sapiens，NM_001260.1)被克隆出来以后，其它物种的CDK8也得到了不同程度的研究，如小鼠(Mus musculus，NM_153599.3)、斑马鱼(Danio rerio，NM_194408.1)、果蝇(Drosophila melanogaster，U33015.1)等，但在对虾中的研究还较少。

斑节对虾(Penaeus monodon)是世界三大对虾养殖品种之一，人工育种过程中广泛采用的剪除单侧眼柄的技术会导致亲虾的高死亡率和产卵质量低等问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的是以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因的全表达序列；此外通过斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因设计荧光定量PCR引物，对细胞周期蛋白依赖性激酶8在斑节对虾卵巢各个发育时相的分布情况及在不同组织中的分布情况进行研究分析。本发明构建了细胞周期蛋白依赖性激酶8原核表达重组质粒，通过原核表达和亲和层析技术在体外成功获得重组蛋白。

本发明提供的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。

该基因的制备方法依次包括下述步骤：

1、总RNA的提取

取健康斑节对虾，解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、精巢、胃等组织，并分别将组织于1mL Trizol(Invitrogen，日本)中匀浆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。

2、cDNA第一链的合成

取上述斑节对虾总RNA 2μL与反转录引物(5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3)1μL(10pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链，反应条件：42℃60min，70℃15min。

3、斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8的PCR扩增、克隆