[发明专利]斑节对虾MAT1基因及其编码的蛋白

说明书

技术领域

本发明公开了斑节对虾MAT1基因及其编码的氨基序列，分析了其在不同组织中及不同发育时相卵巢中的表达分布情况；属于生物基因技术领域。

背景技术

细胞周期调控是一个精确调控的过程。在细胞分裂过程中真核生物的细胞周期可以概括为两个大的阶段：细胞分裂间期(即G1时期、S时期和G2时期)和细胞分裂期(即M时期)，在细胞分裂时期，需要许多周期蛋白参与调控以保证其精确性，CAK(周期蛋白依赖性激酶的激酶)作为CDK激活重要参与因子，在细胞周期调控过程中扮演重要角色。

MAT1做为CAK的重要组成部分，对CAK的活性起着“分子开关”的作用，在调节信号分子转导、控制细胞周期的进程、影响细胞的增殖和凋亡等方面起着关键作用。MAT1是CAK的靶向亚单位，通过调节CAK的活性，影响CDK1、CDK2、CDK4、RNA PolⅡ和细胞周期蛋白等底物的磷酸化，进而影响抑癌基因p53、pRb的磷酸化及总转录因子TFIIH和RNA聚合酶II介导的转录过程,从而可以实现对卵巢发育的调控。

氨基酸序列是组成蛋白质三级结构、研究蛋白质功能的基础，对于研究该蛋白在生长发育过程中的作用具有重要意义。

长期以来，斑节对虾亲虾的人工繁育问题一直都是限制斑节对虾养殖产业发展的技术瓶颈。在实际生产过程中，亲虾的性腺成熟参差不齐，难以集中育苗的问题是对虾养殖过程中一个非常重要的限制因素。眼柄切除手术作为促进亲虾性腺同步成熟的常用方法，对亲虾本身存在非常大破坏性，导致了亲虾较高的死亡率和产卵质量低等问题，不利于可持续养殖，加大了养殖成本。因此出于寻求一种新的对虾繁育方法的需求，对对虾卵巢发育机理及其分子调控机理进行研究势在必行。

发明内容

本发明的是以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾MAT1基因的全表达序列，该序列用于分析斑节对虾生长发育的机制，从而可以从卵巢的发育机制中寻找替代剪除单侧眼柄的方式来促进卵巢成熟的方法，提高亲虾的产卵率及其卵的质量，降低其死亡率。

本发明提供的斑节对虾MAT1基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。

该基因的制备方法依次包括下述步骤：

1、总RNA的提取

取健康斑节对虾，解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、精巢、胃等组织，并分别将组织于1mL Trizol(Invitrogen，日本)中匀浆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。

2、cDNA第一链的合成

取上述斑节对虾总RNA 2μL与反转录引物(5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3)1μL(10pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链，反应条件：42℃60min，70℃15min。

3、引物设计依据，引物合成的方法

根据已有的MAT1的EST序列设计引物：

引物设计后提交上海英骏生物技术有限公司进行合成。

4、斑节对虾MAT1的PCR扩增、克隆

以上述合成的第一链cDNA作为模板，利用cDNA末端快速扩增技术对目的基因的3ˊ末端进行PCR扩增。

在3ˊRACE中，利用降落PCR方法，用接头引物(Adaptor primer：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC<3)和mat1-F1、mat1-F2进行PCR扩增。

所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提交上海英骏生物技术有限公司进行测序。

5、对斑节对虾MAT1基因的测定

所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾细胞MAT1基因同源序列。

6、斑节对虾MAT1的分布和表达