[发明专利]一种重组鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体的纯化及高效复性液对其复性的方法在审
| 申请号： | 201510081740.7 | 申请日： | 2015-02-16 |
| 公开（公告）号： | CN104628832A | 公开（公告）日： | 2015-05-20 |
| 发明（设计）人： | 王连民;刘珂飞;孙珊珊 | 申请（专利权）人： | 天津生机集团股份有限公司 |
| 主分类号： | C07K14/245 | 分类号： | C07K14/245;C07K1/14;C07K1/113 |
| 代理公司： | 天津市三利专利商标代理有限公司 12107 | 代理人： | 仝林叶 |
| 地址： | 300384 天津市*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 重组 大肠杆菌 膜蛋白 包涵 纯化 高效 复性 方法 | ||
1.一种重组鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体的纯化及高效复性液对其复性的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)包涵体蛋白的提取：4℃，4000～6000rpm，10～20min，离心收集菌体，PBS洗涤菌体，4℃，6000～8000rpm，10～20min，将菌体超声破碎，功率400瓦，超声5秒,间歇25秒，工作时间20～35分钟，所述菌体为重组鸡大肠杆菌；然后4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷冻离心得到鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体蛋白质；
(2)包涵体蛋白质的纯化：首先按质量体积比1：10～1：30将包涵体重悬于第一洗涤液中，所述洗涤液为：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L，0.2％～1.4％的tritonX-100，pH 8.0～8.5；4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷冻离心；然后按质量体积比1：10～1：30将包涵体重悬于第二洗涤液种，所述第二洗涤液为：1～3mol/L尿素；4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷冻离心；接着按质量体积比1：20～1：50将包涵体重悬于第三洗涤液中，所述第三洗涤液为：0.6～2mol/L NaCl，4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷冻离心；最后按质量体积比1：30～1：50将包涵体重悬于0.5～2％十二烷基硫酸钠，4℃，8000～10000rpm，20～30min高速冷冻离心，收集沉淀；
(3)包涵体蛋白质的溶解与复性，按质量体积比为1：10～1：40将步骤(2)得到的沉淀用变性剂重悬，所述变性剂为：5～7mol/L盐酸胍，1～2mmol/L EDTA，20～50mmol/L Tris-Base，6～10mmol/L二硫苏糖醇，pH 8.0～8.5；室温放置至沉淀逐渐溶解；4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷冻离心，收集上清液；4℃条件下，使变性液逐滴加入复性缓冲液中，所述复性缓冲液为：0.2～0.8mol/L精氨酸，0.5～2mmol/L EDTA，0.3～0.9mmol/L氧化型谷胱甘肽，60～100mmol/L Tris-Base，15～30％甘油，pH 8.0～8.5，同时搅拌24～48h。
2.根据权利要求l所述的重组鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体的纯化及高效复性液对其复性的方法，其特征在于，步骤(3)中变性液加入复性缓冲液中方式为滴加，变性液与复性缓冲液的体积比为1：20～1：50。
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