[发明专利]一种从动物组织中获得原代细胞的组织块培养方法

说明书

技术领域

本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种从动物组织中获得原代细胞的组织块培养方法。

背景技术

原代培养指的是通过组织块直接长出的细胞或用酶或机械方法将组织分散成的单个细胞的方法，这些细胞和组织刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，多呈二倍体核型，与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大，在一定程度上能反映体内状态。特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。原代细胞是研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖、分化很好的实验对象；还可直接服务于临床实践，例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用；另外，原代培养也是建立各种细胞系(株)必经的阶段。细胞培养技术在生物、医学科学研究中的应用越来越广泛。

机体是由千千万万个形态结构、遗传物质不同的细胞构成，并且细胞与细胞之间存在相互调节、彼此影响，在机体内进行某一类细胞的研究是无法实现的，因为体内环境复杂，条件不容易控制，而建系的癌细胞在培养过程中往往失去了很多原有的特征，大多已发生异倍化，具异倍体核型，不能完全正确的反应体内状态；而且有些部位的细胞又不能够形成稳定的细胞株，如微小血管的平滑肌细胞。因此我们常常需要通过原代培养技术从组织中培养出原代细胞来进行研究.

目前，最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。如欲从胎儿或新生儿的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和胶原酶)消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂(如EDTA)除去细胞互相粘着所依赖的Ca²⁺，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。经我们实验发现分散细胞培养法步骤繁琐，对细胞的影响较大，分散程度不易掌握，在打散细胞连接时会严重破坏细胞膜上表达的蛋白成分，导致蛋白组织学的研究出现假阴性结果，另外，细胞得率低，活力下降，生长缓慢，难以成功传代。而组织块培养法避免了该弊端，具有成功率高、所需组织量少、温和、耗时短、经济、避免外源性蛋白污染等优点(Priya N,Sarcar S,Majumdar AS,et at.Explant culture:a simple,reproducible,efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate[J].J Tissue Engi Regen Med,2012,July 27:1-9.)，对细胞表面的蛋白质损伤比较小，可用于后续细胞表面分子筛选、细胞药物敏感试验、细胞的分选与鉴定等研究。

但是，目前组织块培养法需要组织块贴壁，细胞才有可能爬出，这是本方法最大的难点，组织块贴壁不牢易漂浮，爬出的细胞数就少，现有技术中报道的提高组织块贴壁率的培养方法也不统一，大多是少加培养液，当然还有将组织块上方放盖玻片，或者在培养皿/孔底涂胎牛血清或铺上细胞外基质，或者在培养皿/孔底面先行划痕，甚至划痕、涂胎牛血清两法并用等方法(Elliget,K.A.and Lecher,J.F.Normal human bronchial epithelial cell cultures.In Freshney,R.I.Culture of epithelial cell.New York,Wiley-Liss,1992,181-196.Nicosia,R.F.and Ottinetti,A.Modulation of microvascular growth and morphogenesis by reconstituted basement membrane gel in three-dimensional cultures of rat aorta:A comparative study of angiogenesis in Matrigel,collgen,fibrin,and plasma clot.In Vitro Cell Dev.Biol.1990,26:119-128.)，但这些方法要么操作难度大易污染，要么组织贴壁成功率还是不高，对于不同来源的组织所用的培养方法各异，这些培养技术不仅对实验人员的经验要求很高，而且不容易掌握。