[发明专利]一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法

说明书

本发明涉及一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，步骤为：将新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀获得血浆上清，上清液使用DEAE Sephadex‑A50凝胶吸附处理；血浆上清杂质蛋白沉淀及血浆深层过滤；Capto Heparin亲和层析；S/D病毒灭活及Capto Q离子交换层析去除S/D试剂；纳米膜过滤去除病毒，配制、冻干、干热。该工艺仅使用一步亲和层析制备抗凝血酶Ⅲ，回收率可达40%以上，比活可达8~10IU/mg。

技术领域

本发明涉及生物制品和血液制品生产技术领域，主要涉及血液制品生产中人抗凝血酶Ⅲ分离纯化方法。

背景技术

人抗凝血酶Ⅲ为α₂球蛋白，分子量介于58000~65000Da之间，是人体内重要的抗凝物质，可以在没有肝素的条件下发挥抗凝血作用。抗凝血酶Ⅲ在健康成年人血浆中浓度为100~300μg/ml，人体内抗凝血酶Ⅲ水平低于正常水平的70%时，会使血栓形成的风险升高。人抗凝血酶Ⅲ产品适用于治疗抗凝血酶缺乏的病人，如先天遗传性及获得性抗凝血酶缺乏、弥散性血管内出血（DIC）、败血症、外伤、肿瘤、血栓性栓塞、并发性妊娠等。

1975年Thaler使用肝素亲和层析和聚乙二醇（PEG）沉淀进行血浆纯化、再加入硫酸铵沉淀除去PEG；但经由该方法纯化的抗凝血酶Ⅲ中还含有杂蛋白肝素辅助因子的活性。1981年Mckay用硫酸葡聚糖除去血浆中大部分与肝素结合的非特异性蛋白，再用肝素亲和层析分离抗凝血酶Ⅲ，但比活只能达到4IU/mg。上述两种工艺均以血浆为起始原料，通过加入蛋白沉淀剂去除血浆中的杂蛋白，操作步骤繁琐，杂蛋白去除效果不好，导致产品纯度低、比活低，而且影响血浆中其他蛋白的提取，不利于血浆的综合利用。

1989年Hoffman以Cohn FIV-1沉淀为原料，将沉淀复溶澄清后的上清液经过两次肝素亲和层析，抗凝血酶Ⅲ比活达到了6.4IU/mg。在国内现有已公开和授权的专利（CN201210544111X，CN2013100304464，CN2013106047238）生产工艺中，无论是以FⅣ为原料的工艺路线，还是以血浆为原料的工艺路线，均采用两次或两次以上肝素亲和层析制备抗凝血酶Ⅲ，以达到最终制品抗凝血酶Ⅲ的高纯度和高比活标准。由于上述工艺中均未对起始料液进行澄清预处理，因此必须使用两次亲和层析进行纯化，才能保证产品有较高的纯度和比活。但亲和层析的凝胶一般价格昂贵，生产成本高，并且增加一步亲和层析的同时也提高了亲和配基脱落的风险，给产品质量带来隐患。

发明内容

本发明的目的在于针对目前人抗凝血酶Ⅲ生产工艺中存在的不足，提供一种仅需一步亲和层析即可获得高比活抗凝血酶Ⅲ的工艺方法。

本发明所采用的技术方案如下：

（1）新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀， DEAE Sephadex-A50凝胶吸附；（2）血浆上清沉淀杂质蛋白，深层过滤；（3）滤过液Capto Heparin 亲和层析；（4）S/D试剂病毒灭活，Capto Q离子交换层析去除S/D试剂；（5）纳米膜过滤去除病毒，配制、冻干、干热。

本发明中所述的步骤（1）新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀， DEAE Sephadex-A50凝胶吸附；具体的步骤如下：

将新鲜冰冻人血浆融化混匀后，经连续流离心机去除血浆中的冷沉淀，得到离心后的血浆上清液；

血浆上清采用1~10μm的滤芯过滤，调节血浆pH至6.80~7.20；加入平衡好的DEAESephadex-A50凝胶搅拌吸附30~60分钟，吸附温度≤15℃；采用0.2~1μm微孔滤芯过滤，滤除凝胶获得吸附处理后的血浆上清；DEAE Sephadex-A50干胶量 1.0~2.0g/kg血浆；0.05~0.1mol/L 氯化钠溶液融胀≥8小时；平衡3~5次；再生用1.0～2.0mol/L氯化钠溶液处理，20%乙醇保存；再生次数不超过10次；所述的平衡液：0.015~0.025mol/L 枸橼酸钠，0.14~0.20mol/L氯化钠，pH 6.8~7.2，温度2~8℃；