[发明专利]一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法

权利要求书

1.一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，步骤如下：（1）新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀，DEAE Sephadex-A50凝胶吸附；（2）血浆上清沉淀杂质蛋白，深层过滤；（3）滤过液CaptoHeparin 亲和层析；（4）S/D试剂病毒灭活，Capto Q离子交换层析去除S/D试剂；（5）纳米膜过滤去除病毒，配制、冻干、干热；所述的步骤（1）新鲜冰冻人血浆离心去除冷沉淀， DEAESephadex-A50凝胶吸附；具体的步骤如下：

将新鲜冰冻人血浆融化混匀后，经连续流离心机去除血浆中的冷沉淀，得到离心后的血浆上清液；

血浆上清采用1~10μm的滤芯过滤，调节血浆pH至6.80~7.20；加入平衡好的DEAESephadex-A50凝胶搅拌吸附30~60分钟，吸附温度≤15℃；采用0.2~1μm微孔滤芯过滤，滤除凝胶获得吸附处理后的血浆上清；DEAE Sephadex A50干胶量为 1.0~2.0g/kg血浆；0.05~0.1mol/L 氯化钠溶液融胀≥8小时；平衡3~5次；再生用1.0～2.0mol/L氯化钠溶液处理，20%乙醇保存；再生次数不超过10次；平衡液：0.015~0.025mol/L 枸橼酸钠，0.14~0.20mol/L氯化钠，pH 6.80~7.20，温度2~8℃；

加入1~2倍凝胶体积的洗涤液，搅拌洗涤1~3次，将洗涤液采用0.2~1μm微孔滤芯过滤后，与滤除凝胶后的血浆上清合并，得到处理后的血浆上清；所述的洗涤液：0.015~0.025mol/L 枸橼酸钠，0.14~0.20mol/L氯化钠，pH 6.80~7.20，温度2~8℃。

2.根据权利要求1所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，其特征在于，所述的步骤（2）血浆上清沉淀杂质蛋白，深层过滤；具体步骤如下：

血浆上清沉淀杂质蛋白：

将处理后的血浆上清首先升温至8~10℃，添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为60~100mmol/L，搅拌均匀，用0.1~0.3mol/L的盐酸或氢氧化钠调整血浆上清pH为6.80~7.00；降温至4~6℃，补加添加NaCl至血浆上清中总NaCl浓度为120~200mmol/L，搅拌均匀，用0.1~0.3mol/L的盐酸或氢氧化钠调整血浆上清pH为7.40~7.50；降温至0~2℃，搅拌10~30min后静置30~60min；

深层过滤：

所采用的过滤材质为药用级别纤维素滤板，为一种规格的单层滤板或几种规格的滤板串联叠加使用；使用含有0.1%~10%EDTA的溶液对过滤材质进行清洗，用量为100~300L/m²；再用0.1%~10%的枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗，并洗去残留的EDTA，用量为100~300L/m²；冲洗完成后排干设备内的溶液，用于血浆过滤；

过滤后的血浆上清在进行柱层析的同时，使用0.2μm的滤芯进行在线的膜过滤。

3.根据权利要求1或2所述的一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，其特征在于，步骤（3）滤过液Capto Heparin 亲和层析具体为：

深层过滤后的滤过液，通过装填有Capto Heparin的肝素亲和凝胶的层析柱进行固定床亲和层析，凝胶中结合在琼脂糖基架上的肝素配基将捕获血浆中的抗凝血酶Ⅲ；用平衡液将层析柱中未吸附的其他血浆成分洗涤干净，用洗脱液洗脱被吸附的抗凝血酶Ⅲ；每次上样量控制为20~30个柱床体积；所述的平衡液：含磷酸氢二钠10~30mmol/L、氯化钠0.3~0.6mol/L，pH6.50~7.50；所述的洗脱液：含磷酸氢二钠10~30mmol/L、氯化钠1.5~2.5mol/L，pH6.50~7.50；平衡、上样和洗脱线流速180cm/h~300cm/h；柱再生：分别用0.1mol/L氢氧化钠、洗脱液、注射用水进行处理；柱保存：20%乙醇溶液保存。