[发明专利]一个牛α-actin基因的启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一个牛α-actin基因的启动子及其应用，属于遗传工程技术领域。

背景技术

真核生物的基因表达调控是一个复杂而严密的过程。在转基因动物的研究中，获得能广泛应用的高效特异性的启动子对于外源基因的表达具有十分重要的意义。启动子是基因(gene)的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸(nucleotides)，那么启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录(transcription)因子的这种蛋白质(proteins)结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶(enzymes)(RNA聚合酶polymerases)的活动。这种酶制造着基因的RNA复制本。一般分为广谱表达型启动子、组织特异性启动子、肿瘤特异性启动子等多种形式。启动子区的基本结构：启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。因为基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，故RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是转录起始过程中首先要解决的问题。有实验表明，对许多启动子来说，RNA聚合酶与之相结合的速率至少比布朗运动中的随机碰撞高100倍。转录单元(transcription unit)是一段从启动子开始至终止子(terminator)结束的DNA序列，RNA聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。在细胞中，一个转录单元可以是一个基因，也可以是几个基因。转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即5’末端的序列称为上游(upstream)，而把其后而即3’未端的序列称为下游(downstream)。在描述碱基的位置时，一般用数字表示，起点为+1，下游方向依次为+2、+3……，上游方向依次为-1、-2、-3……。启动子的特异性由多个元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织中能够高效特异性地表达，启动子的选择是构建其表达载体的重要的条件之一。目前对于转基因动物领域启动子活性的研究通常采用启动子缺失片段活性分析法。即根据转录因子预测软件分析和确定启动子缺失片段大小，采用PCR法获得不同大小的缺失片段。然后通过pGL3-Basic构建启动子活性检测载体，通过双荧光素酶活性测定试剂盒检测启动子缺失片段活性。如果启动子缺失片段之间出现特殊活性变化，可通过碱基突变实验进行验证。赵丹丹(2009年)对牛α-actin启动子进行了缺失突变研究，证明牛α-actin启动子各缺失片段都具有很强的肌肉特异性，并且证明其中有一段转录活性相对较高，且长度适中(262bp)。但是它的转录活性与一些强启动子相比仍然较低。如何寻找到一种能够提升α-actin基因的表达活性且具有较强的肌肉特异性的启动子以应用于提高肌肉产量的转基因肉牛生产成为急需解决的一大难题？所以，发明一个牛α-actin基因的启动子及其应用，寻找到一个具有较强的启动活性和骨胳肌特异性并在牛骨胳肌卫星细胞中能够显著提高α-actin基因表达活性的启动子是必要的。

发明内容