[发明专利]猪链球菌SBP_bac_5基因缺失株及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于细菌基因工程技术领域，涉及一种不含抗性标记的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株及其构建方法与应用。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)为革兰氏阳性球菌，是一种重要的人畜共患病病原菌。我国曾于1998年和2005年暴发了两次较大规模的猪及人感染S.suis病的事件，累计报告人感染S.suis病例达204例，其中死亡38例，严重影响公共卫生安全。至今为止，对此病的预防仍缺乏有效的疫苗。目前研究表明S.suis荚膜抗原血清型有35种以上，其中血清2型为世界范围内的主要致病菌型。然而，近几年在全世界病猪检测中频繁报导S.suis 7型，其所占的比例有增多趋势，在某些地区甚至超过了2型，特别是近几年湖北省境内就已有7型感染增多的报道。根据本实验室的流行病学调查结果，现地流行的血清型呈多样性存在，血清7型的比例有增高的趋势，基于上述现象，对S.suis 7型各方面特性的研究也就显得非常必要。

文献报道，SBP_bac_5蛋白具有类似分子伴侣的活性，在病毒感染过程中发挥重要作用。如分子伴侣蛋白具有促进病毒蛋白发生正确折叠和集合的功能，并且对腺病毒、痘苗病毒和乳头瘤病毒的生长具有重要作用，已有研究证实SBP_bac_5是一个假定的毒力相关因子，具有类似分子伴侣的活性，在感染过程中发挥重要的作用，而其在细菌中的作用至今仍无报道。我们通过比较蛋白质组学和荧光定量PCR检测表明SBP_bac_5在S.suis 7型强弱毒株的表达量显著差异，即SBP_bac_5蛋白在S.suis 7型强毒株WC-ss7中表达量比在弱毒株M13中表达量多。通过预测软件分析SBP_bac_5蛋白有转运蛋白活性，且为假定分泌蛋白，其分子功能是直接运输物质如大分子、小分子、离子等进出细胞；这更进一步提示SBP_bac_5基因与S.suis致病力的相关性。

目前商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型菌引起的临床症状并降低死亡率，但不能阻止组织病变、慢性感染，对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护。因此，采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择，迫切需要更安全、更高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。而且弱毒活疫苗与传统疫苗相比有能够重复提呈抗原和持续性刺激免疫应答的优点。因此通过缺失毒力因子构建弱毒活疫苗已成为国内外疫苗研究的热点。

鉴于上述背景，为准确阐明SBP_bac_5在细菌中的生物活性及功能，采用RecA同源重组系统，利用温敏自杀质粒pSET4s作为敲除的载体构建我国流行的S.suis 7型菌株的SBP_bac_5基因缺失株，研究其对动物的致病性和免疫原性，为S.suis的防治及S.suis疫苗的研制奠定基础。

发明内容

本发明目的之一是提供一种不含抗性标记的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株，该缺失株是将猪链球菌菌株SBP_bac_5编码的基因进行敲除的菌株。

本发明的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株衍生于本试验室研究人员分离的S.suis血清7型WC-ss7流行株(保藏号为CGMCC No.3343)，将其基因组上的SBP_bac_5基因缺失，使SBP_bac_5蛋白不表达，获得了不含抗性标记的SBP_bac_5基因缺失突变株。

本发明的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株为不含抗性标记的SSΔSBP_bac_5，其分类命名为猪链球菌Streptococcus suis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.10076，保藏日期为2014年11月28日。

本发明目的之二是提供一种构建所述的不含抗性标记的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株的方法，其特征是将含有待敲除的目的基因的上、下游同源臂基因DNA片断的pSET4s质粒导入所述的猪链球菌血清7型菌株，经同源重组而实现的。其中，所述的DNA片断从上游至下游依次是SBP_bac_5上游同源臂、SBP_bac_5下游同源臂，与所述的猪链球菌7型菌株的SBP_bac_5蛋白编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组，得到的SBP_bac_5基因缺失株SSΔSBP_bac_5。具体构建方法如下：