[发明专利]一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法。该方法通过对MitTx蛋白编码序列进行优化，利用大肠杆菌进行重组表达，表达的蛋白经过复性纯化得到具有生物学活性的重组蛋白。

背景技术

MitTx是Bohlen于2011年从德克萨斯州珊瑚蛇毒液中分离得到，由α和β亚基组成，这2个亚基可以以1:1的非共价方式相互作用(Kd＝12.2±3.1nM)。其中α亚基由61个氨基酸组成，包含3对二硫键，分子量为7.26kD；β亚基包含126个氨基酸，含有7对二硫键，分子量为14.50kD(见图3)。2个亚基本身不能激活感觉神经元，当二者结合后细胞内Ca²⁺浓度很快增加。研究发现，MitTx可以激活同源或异源型酸敏感离子通道蛋白(ASIC)1a(EC₅₀＝9.4±1.3)，1b(EC₅₀＝23±3.6nM)，对ASIC3有弱的作用(EC₅₀＝830nM)。

2014年Gouaux率先解析了小鸡ASIC1a全长与MitTx复合物的晶体结构。结构的解析阐述了一种新的痛觉产生机制，同时也表明MitTX在这种痛觉产生机制上的重要性，因此MitTx蛋白的提取与纯化工艺非常关键。从珊瑚蛇毒液中提取MitTx过程复杂、成本昂贵，加之蛋白产量低，成分复杂等，使科研和应用大大受限。而且，MitTx特别是β亚基分子内半胱氨酸数目多，且都形成了二硫键，这样一来合成折叠非常困难。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法包括如下步骤：

(1)优化MitTxα及MitTxβ的编码序列，优化后的MitTxα的编码序列如SEQ ID NO.1所示，优化后的MitTxβ的编码序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)以优化后的MitTxα的编码序列为基础构建重组载体MitTxα-pET22b；以优化后的MitTxβ的编码序列为基础构建重组载体MitTxβ-pET22b；所述重组载体MitTx α-pET22b的序列如SEQ ID NO.3所示；所述重组载体MitTxβ-pET22b的序列如SEQ ID NO.4所示；

(3)将重组载体MitTxα-pET22b和重组载体MitTxβ-pET22b转化大肠杆菌，并 制备MitTxα包涵体和MitTxβ包涵体；

(4)分别对MitTxα包涵体和MitTxβ包涵体进行复性；将复性后的MitTxα包涵体和MitTxβ包涵体分离纯化，得到MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白，MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共价结合，得到重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx。

优选地，步骤(4)所述复性中，MitTxα包涵体的复性条件为：0.2M Arg-HCl(pH 8.8),32mM L-cys，1mM胱氨酸；MitTxβ包涵体的复性条件为：50mM NDSB-201，0.2M Arg-HCl(pH 8.8)；32mM L-cys，1mM胱氨酸。

优选地，步骤(4)所述MitTxα包涵体分离纯化包括透析去沉淀、阳离子交换、分子筛层析的步骤；其中，透析时pH值调为5.0-5.5；MitTxα在mono S 5/50洗脱电导为25ms/cm，在superdex75 10/300上洗脱体积为17.80-18.20mL。

优选地，步骤(4)所述MitTxβ包涵体分离纯化包括透析弃沉淀、阴离子交换、阳离子交换、分子筛层析的步骤；其中，透析时pH值调至8.5-9.0，透析后用Mono Q阴离子交换纯化收集流穿的MitTxβ；Mono Q的流穿MitTxβ再经pH 5.0-5.5的20mM NaAC透析后利用Mono S进一步纯化,洗脱电导为25ms/cm，在superdex7510/300上洗脱体积为13.80-13.90mL。

优选地，步骤(4)所述MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共价结合是将MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白等比例混合，放置10—20min后过Superdex75柱子，洗脱体积为13.46-13.55mL时，得到重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx。