[发明专利]一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法

权利要求书

1.一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)优化MitTxα及MitTxβ的编码序列，优化后的MitTxα的编码序列如SEQ ID NO.1所示，优化后的MitTxβ的编码序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)以优化后的MitTxα的编码序列为基础构建重组载体MitTxα-pET22b；以优化后的MitTxβ的编码序列为基础构建重组载体MitTxβ-pET22b；所述重组载体MitTxα-pET22b的序列如SEQ ID NO.3所示；所述重组载体MitTxβ-pET22b的序列如SEQ ID NO.4所示；

(3)将重组载体MitTxα-pET22b和重组载体MitTxβ-pET22b转化大肠杆BL21表达菌株，并制备MitTxα包涵体和MitTxβ包涵体；

(4)分别对MitTxα包涵体和MitTxβ包涵体进行复性；将复性后的MitTxα包涵体和MitTxβ包涵体分离纯化，得到MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白，MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共价结合，得到重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述复性中，MitTxα包涵体的复性条件为：0.2M Arg-HCl(pH 8.8),32mM L-cys，1mM胱氨酸；MitTxβ包涵体的复性条件为：50mM NDSB-201，0.2M Arg-HCl(pH 8.8)；32mM L-cys，1mM胱氨酸。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述MitTxα包涵体分离纯化包括透析去沉淀、阳离子交换、分子筛层析的步骤；其中，透析时pH值调为5.0-5.5；MitTxα在mono S 5/50洗脱电导为25ms/cm，在superdex7510/300上洗脱体积为17.80-18.2mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述MitTxβ包涵体分离纯化包括透析弃沉淀、阴离子交换、阳离子交换、分子筛层析的步骤；其中，透析时pH值调至8.5-9.0，透析后用Mono Q阴离子交换纯化收集流穿的MitTxβ；Mono Q的流穿MitTxβ再经pH5.0-5.5的NaAC透析后利用Mono S进一步纯化,洗脱电导为25ms/cm在superdex7510/300上洗脱体积为13.80-13.90mL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共价结合是将MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白等比例混合，放置10—20min后过Superdex75柱子，洗脱体积为13.46-13.55mL时，得到重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx。

6.一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx优化编码序列，其特征在于，所述重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx优化编码序列包括如SEQ ID NO.1所示的MitTxα编码序列和如SEQ ID NO.2所示的MitTxβ编码序列；MitTxα编码序列编码的MitTxα蛋白的序列如SEQ ID NO.5所示，MitTxβ编码序列编码的MitTxβ蛋白的序列如SEQ ID NO.6所示，MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白为重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的两个亚基，MitTxα蛋白和MitTxβ蛋白非共价连接。