[发明专利]一种稗草组织培养成苗的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种稗草组织培养成苗的方法。

(二)背景技术

稗草(Echinochloacrus-galli)是世界性的农田恶性杂草，主要通过化学农药防治。由于连续多年使用单一除草剂，稗草已经对10类不同作用机理的除草剂产生了抗药性(Heap,2015)。抗性稗草引起农药的用量增加、残留和污染等问题，严重制约农业可持续发展，成为是农业生产的难题。研究稗草的抗药性机理是解决抗药性问题的重要途径，其中稗草转基因是验证抗药基因功能的主要技术，但是目前缺少获得高效稗草受体系统的方法。建立稗草基因转化受体系统是实现外源基因转化的先决条件，而高效受体系统的获得依赖稗草组织培养技术。

目前有关稗草组织培养的文献还比较少。检索Springer，ScienceDirect，Wiley online library，ProQ uest等主要外文数据库。其中1984年Wang da yuan等首次通过稗草花序作为外殖体在含有2,4-D和6-BA的MS培养基上获得白色、紧密的胚状体，并通过调节2,4-D的含量继续培养获得了稗草的再生苗。这种方法不经过组织培养阶段，而是直接由外殖体得到胚状体进而发育成苗，至少需要半年时间，具有试验难度高，不易大规模培养，时间长，重复性差等特点。

(三)发明内容

为解决现有技术中以稗草花序作为外殖体得到胚状体进而发育成苗试验难度高、时间长、重复性差，不宜大规模培养的不足，本发明以稗草成熟胚作为外殖体通过种子处理，愈伤诱导，芽分化、生根培养和激素的选择等研究，探索通过组织培养获得稗草再生苗的方法，建立稗草基因转化过程中的植物受体系统，为稗草组织培养和转基因研究提供基础信息。

本发明采用的技术方案是：

一种稗草组织培养成苗的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)种子处理：选取常规对二氯喹啉酸敏感的稗草种子(如Echinochloa crusgalli、Echinochloa crusgalli var.zelayensis、Echinochloa crusgalli var.mitis等)，去除种皮与一半胚乳，将带胚乳的半粒种子在室温下用灭菌水浸泡3～4小时后，着用60～70％乙醇浸泡30～60秒，再用无菌水冲洗2～3次，接着用0.05～0.1％(m/v，1％表示100mL溶液含有1g溶质)的升汞边振荡边消毒10～15分钟，接着再用无菌水冲洗4～5次，最后一次浸泡20～30分钟，再用无菌水边振荡边清洗1次，然后在超净台上将种子置于无菌滤纸上10～15min；

(2)愈伤诱导培养：将处理后的种子放在愈伤组织诱导培养基上，在28～30℃黑暗培养6～8天；所述愈伤组织诱导培养基组成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，1.0～2.0mg/L2,4-D，0.2～0.3mg/L 6-BA，0.1～0.2mg/L NAA，溶剂为MS培养基；

(3)继代培养：挑选白色、紧实、未污染的愈伤转移到继代培养基上，在28～30℃、3000～4000lx光照16小时、黑暗8小时条件下，培养5～8天；所述继代培养基组成如下：0.2～0.3mmol/L甘露醇，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，0.5～0.8mg/L 2,4-D，0.5～0.8mg/L6-BA，溶剂为MS培养基；

(4)愈伤分化培养：挑选紧实、未污染的愈伤转移到分化培养基上，在28～30℃、3000～4000lx光照16小时、黑暗8小时条件下，培养10～14天；所述分化培养基组成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，0.2～0.4mg/L ZT，1.0～2.0mg/L NAA，溶剂为MS培养基；

(5)生根培养及移栽：挑选已经生芽、未污染的愈伤转移到生根培养基上，在28～30℃16小时光照、黑暗8小时、3000～4000lx光强条件下，培养7～8天，待根长出后，用自来水浇灌3天，然后移栽土壤；所述生根培养基组成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，溶剂为1/2MS培养基。

植物组织培养的原理是利用细胞的全能性，将离体的体细胞或单倍体细胞诱导成体细胞胚或胚状体进而发育成完整的植株的过程，其中胚状体具有很强的接受外源DNA的能力，是理想的基因转化感受态细胞，本发明方法通过愈伤诱导等组织培养方法成功得到再生苗，为稗草的转基因研究创造了很好的工具。