[发明专利]一种培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽医微生物学技术领域，涉及一种高效培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法。

背景技术

猪支原体肺炎又称猪地方性流行肺炎(Swine enzootic hyopneumoniae)，我国俗称猪喘气病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病。主要临诊症状是咳嗽和气喘，常有其他病菌(如多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等)继发感染。本病广泛分布于世界各地，在我国许多地区的猪场都有发生。由于带菌病猪的存在和分布较广，通常会引起猪群生产性能显著下降，受感染猪群日增重下降，饲料报酬降低，上市时间延迟，猪群生长均匀度较差，药物治疗成本增加，因而给猪场造成较为严重的经济损失。由国内外临床经验可知，接种疫苗，能够显著的降低猪肺炎病变程度，降低饲养成本，是一种比较可行的预防方法。

目前培养猪肺炎支原体的培养基主要有1975年Goodwin等发明的Friis培养基，1975年江苏农科院发明的KM₂培养基，2000年版兽医生物制品制造及检验规程中提出的猪肺炎支原体培养基，2006年农业行业标准中提出的A26培养基。

以上述传统培养基及培养工艺培养自行分离的猪肺炎支原体CJ株的共同缺点是，生长速度较慢，且含菌量较低(在1.0×10^7-8CCU/ml之间)，从而影响疫苗的免疫效力。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法，该培养基是由基础培养基和辅助培养基制成，采用先配制基础培养基，再配制辅助培养基，然后混合，调整pH，过滤除菌，即得到猪肺炎支原体液体或固体培养基。本发明所述的猪肺炎支原体培养基培养猪肺炎支原体CJ株的生长时间为2-3日，含菌量为1.0×10^9-10CCU/ml，达到最终含菌量的测定时间为9-10日，说明本发明制备的培养基培养猪肺炎支原体CJ株含菌量高于现有技术的培养基，具有生长迅速，含菌量高的特点；该培养基制备方法工艺简单，适合工业化大生产。适用于培养猪肺炎支原体CJ株生长。

本发明所述的一种培养猪肺炎支原体的培养基，该培养基是由基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml、琼脂粉0-15.0g，辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25％酚红5-10.0ml、灭活的猪血清100-250.0ml制成。

所述的培养猪肺炎支原体培养基的制备方法，按下列步骤进行：

a、制备基础培养基：

将基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml和琼脂粉0-15.0g混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度100℃加热10分钟，冷却后备用；

b、制备辅助培养基：

将辅助培养基为10×汉克氏(Hank′s)平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25％酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml混合搅拌均匀，使之完全溶解，在温度4℃保存备用；

c、将步骤a基础培养基和步骤b辅助培养基混合，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.6，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得猪肺炎支原体的液体或固体培养基。

该培养基中的酵母浸出液为取干酵母粉100g，加去离子水1000ml，充分混匀后，在温度37℃下发酵60分钟，煮沸10分钟，冷却，再以10000r/min离心20分钟，收取上清液，将上清液过滤除菌，定量分装，置于温度2-8℃保存备用。

该培养基中的10×Hank′s平衡盐溶液为CaCl₂1.4g，KCl 4.0g，KH₂PO₄0.6g，MgCl₂·6H₂O 1.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，NaCl 80.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 1.5g，加去离子水至1000ml。