[发明专利]一种混合蛋白酶体系、包含该混合蛋白酶体系的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种用于基因克隆与组装的混合蛋白酶体系，其特征在于，所述混合蛋白酶体系在40-70℃高温下保持活性。

2.如权利要求1所述的混合蛋白酶体系，其特征在于，所述混合蛋白酶体系包含嗜热性增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)；

优选地，所述嗜热性增殖细胞核抗原为来源于激烈热球菌的增殖细胞核抗原(Pfu-PCNA)或超嗜热菌的增殖细胞核抗原(KOD-PCNA)中的任意一种或两种的混合物。

3.如权利要求2所述的混合蛋白酶体系，其特征在于，所述混合蛋白酶体系还包含核酸外切酶、嗜热性单链DNA结合蛋白或嗜热性DNA聚合酶中的任意一种或至少两种的混合物。

4.如权利要求3所述的混合蛋白酶体系，其特征在于，所述核酸外切酶为λ噬菌体核酸外切酶、T5噬菌体核酸外切酶、T7噬菌体核酸外切酶、大肠杆菌核酸外切酶I、大肠杆菌核酸外切酶III、大肠杆菌核酸外切酶VII、Redα或RecE中的任意一种或至少两种的混合物；

优选地，所述嗜热性单链DNA结合蛋白为来源于嗜热型栖热菌(Thermus thermophilus)的单链DNA结合蛋白、来源于水生型栖热菌(Thermus aquaticus)的单链DNA结合蛋白或来源于激烈热球菌(Pyrococcus furious)的单链DNA结合蛋白中的任意一种或至少两种的混合物；

优选地，所述嗜热性DNA聚合酶为经改良后的保真性高的Taq DNA聚合酶、Pyrobest DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶或Pwo DNA聚合酶中的任意一种或至少两种的混合物。

5.一种含有如权利要求1-4任一项所述混合蛋白酶体系的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应缓冲液；反应缓冲液包含缓冲剂、盐和dNTP，可以包含：Tris、MgCl₂、EDTA、甘油、牛血清白蛋白、dNTP、PEG和二硫苏糖醇；优选地，所述反应缓冲液包含：20-150mM的Tris-HCl,pH 7.0-8.0、1-6mM的MgCl₂、0.1-1mM的EDTA、1-5％的甘油、10-50mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)、0.1-0.3mM的dNTP、1-5％PEG、0.1-1mM的二硫苏糖醇(DTT)。

6.一种基因克隆与组装的方法，其特征在于，其包括如权利要求1-4所述包含该蛋白酶体系和反应缓冲液的试剂盒，使目标PCR产物参与同源重组反应，从而将其融入所需的载体中，由此得到在载体中特异性地插入有目标PCR产物的重组DNA分子。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，利用该蛋白酶体系和反应缓冲液介导的体外同源重组反应对目标DNA片段进行快速克隆，具体操作步骤为：先通过在PCR扩增引物5’端引入附加序列使得目标DNA两末端与载体DNA两末端分别带有至少15bp的同源序列，然后目标DNA与线性化的载体DNA在40-70℃高温下经该蛋白酶体系和反应缓冲液的催化形成重组中间体，最后该中间体直接转化到感受态细胞即可完成目标DNA至载体DNA的克隆过程；

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)线性化载体的制备：采用酶切法或PCR法获得线性化载体；所述酶切法为单酶切或双酶切，优选为双酶切；所述PCR法为采用高保真的DNA聚合酶扩增载体；优选地，对获得的线性化载体进行割胶纯化；

(2)目标片段的PCR扩增：用于目标DNA的PCR扩增的正向引物5’端需添加至少15bp与载体DNA 5’端同源序列，即其5’端反义链末端最后15bp碱基序列；用于目标DNA PCR扩增的反向引物5’端需添加至少15bp与载体DNA3’端同源序列，即其3’端正义链末端最后15bp碱基序列。

(3)同源重组并进行转化：采用如权利要求5所述试剂盒，将目标片段和线性化载体加到含有如权利要求1-5任一项所述混合蛋白酶体系和反应缓冲液的试管中在40-70℃高温下进行重组反应，实现在载体中特异性地插入目标片段，然后将得到的重组DNA分子进行转化到感应态细胞中；优选地，步骤(3)所述同源重组中，目标片段和线性化载体的摩尔比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，优选为2:1、3:1；优选地，所述载体的用量为10-200ng优选地，所述同源重组的反应时间为20-60分钟，优选为30分钟。优选地，所述同源重组的反应温度为40-70℃，优选为45-60℃。