[发明专利]一种能够生产人神经生长因子的转基因小鼠的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产转基因小鼠进而生产人神经生长因子的方法，属于分子遗传学和细胞生物学领域。

背景技术

神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF包含α、β、γ三个亚单位，活性区是β亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体。目前，临床使用的NGF多为动物(小鼠)基因表达产物，虽然NGF的生物效应无明显的种间特异性，但是有研究表明人的NGF具有显著高于鼠源NGF的生物学活性。因此，采用人NGF用于临床治疗具有鼠源NGF无法比拟的优点。目前有采用重组方法生产的人NGF的报道。但是由于NGF分子结构的特殊性，很难获得具有生物学活性的重组人NGF。也有通过转基因的方法使人NGF在转基因小鼠体内表达的技术，但是外源基因在小鼠的基因组中是随机整合，其表达水平变化比较大。另外，在纯化过程中，会同时获得人NGF和鼠NGF，因此纯度达不到要求。

基因敲入技术是一项利用同源重组的原理，在小鼠的胚胎干细胞(ES细胞)中定位整合外源基因，使外源基因可以在小鼠体内表达的技术，在外源基因定位整合的同时，可以将整合位点小鼠的内源基因完整或者部分取代，成为一种特定基因人源化的转基因小鼠模型。目前这种技术已经用于基因表达调控的研究

目前利用基因敲入技术已获得多种特定基因人源化的基因敲入小鼠模型。例如人alpha-珠蛋白的基因敲入模型。通过分别在人alpha-珠蛋白基因的5’-端和3’-端连接小鼠alpha-珠蛋白基因的5’-端和3’-端DNA序列，构建同源重组载体，然后将载体导入小鼠的ES细胞，载体上的小鼠alpha-珠蛋白基因的5’-端和3’-端DNA序列和小鼠染色体上的alpha-珠蛋白基因5’-端和3’-端DNA序列发生2次同源重组，从而将人的alpha-珠蛋白基因序列定位整合在小鼠的alpha-珠蛋白基因位置上，同时将小鼠内源性的alpha-珠蛋白基因删除。这样，小鼠的红细胞中就可以表达人的alpha-珠蛋白基因，其表达水平与小鼠内源性alpha-珠蛋白基因的表达相当。

如果通过基因敲入的方法，采用人的NGF基因在小鼠基因组中定位替换鼠的NGF基因，可以使人NGF基因在小鼠内源性NGF的表达调控序列控制下表达，在纯化时也不会有鼠源NGF的污染。但是利用常规基因敲入技术获得NGF基因敲入的小鼠存在很多的困难或风险，例如，在基因敲入的过程中需要在ES内发生2次同源重组，经过2次筛选，一次正的筛选，一次负的筛选，才能获得阳性克隆。同源重组载体进入ES细胞内后，可以随机插入小鼠基因组的任何序列，造成假阳性结果，导致小鼠内源性NGF基因不能正确的删除。

2007年Barrangou等人首次发现并证明细菌可以利用Cas/CRSPR系统对抵抗噬菌体入侵。2008年Marraffini等人又发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了Cas/CRISPR系统的功能。CRISPR/Cas系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特异性切割，主要依赖crRNA与Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM以及protospacer。根据CRISPR/Cas系统这一特性将它设计为人工的核酸内切酶(Engineered endonuclease，EEN)，用它来对科学家感兴趣的基因位点进行修饰。酿浓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的TypeⅡ型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶，已经在人类细胞、小鼠、斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰。

为解决基因重组现有技术存在的上述问题，本发明人意欲通过利用Cas-9/CRSPR介导的基因组编辑技术，提供一种同源重组位点准确，成功率高的同源重组方法，以获得整合有人NGF基因的转基因小鼠，并进而提供一种制备具有高生物效能人NGF的方法。

发明内容