[发明专利]一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用。

背景技术

随着对饲料原料的不断开发和研究，将小麦作为玉米的替代资源加以利用，具有一定的现实意义和经济价值。但小麦中含有较高的非淀粉多糖(NSP)，以阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖为主。

木聚糖是通过木糖苷键连接的木糖聚合物，侧链上常具有多种取代基。它是植物半纤维素的重要组成部分，占植物碳水化合物总量的1/3，其含量仅次于纤维素，是在自然界中一类重要的再生生物资源。

因单胃动物消化道内缺乏消化这类多糖的内源酶，故这些物质不能被消化利用，而且会影响其他养分的吸收利用，具有很强的抗营养作用，从而影响单胃动物的生产性能。降解木聚糖的酶类主要是以内切方式水解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键的酶，其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的低聚木糖，也有少量木糖和阿拉伯糖。

为解决这一问题，针对不同饲料国内外已提出了许多改进措施，如加强原料的品种培育、脱壳、加外源性酶制剂等，其中，加外源性酶制剂被认为是最有潜力的途径，因为它可以针对其中的特异性底物专一性的发挥作用，不仅可以降低或消除非淀粉多糖等抗营养因子的抗营养作用，而且可使一部分营养物质得以利用，提高整个营养物质的消化利用率，从而提高饲料的利用价值。因此，向日粮中添加木聚糖酶可以有效的解决木聚糖的抗营养作用。但饲料在加过过程中要经过高温制粒过程，普通木聚糖酶在这一过程中会丧失活性，研制耐热木聚糖酶具有非常重要的意义。

目前提高酶热稳定性的主要方法有自然选择法、蛋白质工程法、化学修饰法等。基因工程技术和生物信息学的快速发展，为分子生物学的研究开辟了新的前景。我们可以运用生物信息学及计算机相关软件对酶分子进行定向改造提高其热稳定性，然后使用基因工程的手段对木聚糖酶进行改造，以加速木聚糖酶在各种领域中的应用过程。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种耐热木聚糖酶，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码前述木聚糖酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了含有前述编码基因的载体或质粒。

本发明还提供了含有前述编码基因的工程菌。

本发明还提供了一种分泌耐热木聚糖酶的菌株，分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2015年1月19日，保藏编号为CGMCC No.10369。

本发明还提供了前述编码基因在制备单胃动物饲料中的应用。

本发明还提供了前述工程菌在制备单胃动物饲料中的应用。

本发明还提供了前述菌株在制备单胃动物饲料中的应用，具体为：利用所述菌株分泌表达的木聚糖酶具有热稳定性，在饲料的制备过程中不会因高温而失活，使得饲料中含有具有活性的木聚糖酶。

本发明的有益效果在于：

本发明通过基因工程技术，以硫色曲霉(Aspergillus sulphureus)的木聚糖酶基因序列(GenBank登录号：DQ355509)为模板，进行重叠PCR和反向PCR以引入二硫键和脯氨酸，构建突变质粒，并将其转入毕赤酵母中，从而能获得耐热木聚糖酶。在5升发酵罐的发酵活力达到1684U/mL，最适催化温度为55℃，最适pH值为3.0。在60℃、70℃和80℃条件下，半衰期分别为39.6、9.5和1.6min，同时，该木聚糖酶在低pH值的高催化活性、耐酸性及金属离子耐受性，使之在饲料添加剂领域中具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明获取突变xynA^53-142-46基因序列的流程图。

图2为本发明毕赤酵母工程菌X-33/xynA^53-142-46在5L发酵罐中的发酵过程；

其中：a1：利用以葡萄糖为基础的碳源；a2：在葡萄糖用尽后(以溶氧量为指标)，向培养基中加入50％(v/v)甘油；a3：甲醇诱导阶段。■：湿菌重；▲：木聚糖酶活性，取三次测量值的平均值。