[发明专利]一种以1,4,7,10-四氮杂环十二烷为骨架的手性顺磁探针

说明书

技术领域

 本发明属于化学生物学研究中的高性能探针，特别是一种以1,4,7,10-四氮杂环十二烷（cyclen）为骨架的手性顺磁探针。

背景技术

蛋白质空间结构是其生物功能的基础。顺磁效应下的核磁共振由于其独特的性质，近年来在生物大分子（如蛋白质、DNA、RNA等）的结构和功能研究中发挥着越来越强大的作用；顺磁效应能够提供其它技术手段难以获得的大分子长程结构信息；功能化的顺磁标签则是顺磁技术中修饰蛋白质最为重要的技术手段之一。

顺磁标签的质量对利用顺磁核磁研究生物大分子的结构与动态学关系起着决定性的作用。顺磁标签一般均是一些具有双功能团的小分子探针，一端用于顺磁金属离子的螯合，另一端则用于与蛋白质连接。将顺磁标签与生物大分子连接后，利用顺磁效应可以揭示生物大分子的作用机制和作用构象变化、小分子与大分子作用的高分辨结构（参见：J. Biomol. NMR, 2010, 46: 101-112），这将对有效药物先导分子进行筛选与优化起到重要的导向作用。

一个好的标签通常需要需要满足以下条件：1）标签连接的刚性。当标签与顺磁金属离子结合后，若此顺磁标签和蛋白质的相对位置发生变化，会使PCS（贋接触化学位移）和RDC（残余偶极耦合）明显降低；2）光学纯度单一，金属离子和具有多个潜在手性中心的标签结合后，会产生对映异构体，导致出现多套NMR信号，进而使图谱变得复杂而难以解析；3）标签与蛋白链接的稳定性。

Su等（Chembiochem, 2006, 7: 1599–1604.），首先用Ellman’s试剂5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）活化蛋白质的巯基形成二硫键，过量的DTNB通过透析除去；之后加入等量的标签，标签中的巯基即和活化的二硫键反应生成新的二硫键，最终把多肽标签和蛋白质连接起来（反应过程见图1）。离去的5-巯基-2-硝基苯甲酸（TNB）呈现明显黄色，这为反应过程的检测提供了很大的便利。这种标记方法产率较高（>70%），因为LBT多肽标签酸性很强，与蛋白质连接之后其pI值会明显改变，所以可以通过离子交换色谱柱将连接产物和未连接蛋白质分离。然而，二硫键不稳定，这阻碍了此类标签的广泛应用。

Prudencio等（Chem. Eur. J., 2004, 10(3): 3252～3260.）报道了具有两个活性巯基的化合物L-1（见图2），其由DTPA双酸酐和S-(2-氨乙基)甲烷硫代磺酸反应得到，合成方法简单。此标签可以和蛋白质上距离8～10?的两个半胱氨酸残基同时反应，形成两个二硫键，增加了标签的刚性，限制了标签相对于蛋白质的运动，避免了PCS的平均化，在距离顺磁金属离子4nm处仍有明显的PCS。但是由于其存在多个手性中心，与蛋白质连接以后，滴加顺磁金属离子，会产生至少5个顺磁信号峰，致使¹H-¹⁵N HSQC谱图非常复杂。

Li等（Chem. Commun. , 2012, 48: 2704–2706.）首次报道了利用末端烯键与蛋白质侧链巯基的迈克尔加成反应将化合物L-2（见图2）定点标记到蛋白质上，加成产物含有硫醚键，它可以在还原性环境和碱性条件下稳定存在。然而化合物L-2只有三个配位点，镧系金属离子和其配位以后，还能结合其他配位原子。

Vlasie等（Chem. Eur. J., 2007, 13(6): 1715～1723.）报道了化合物L-3（见图2），它通过两个二硫键和蛋白质上的两个巯基连接，这种连接方式增加了标签的刚性，降低了顺磁标签相对于蛋白质的运动。但是作者发现L-2和蛋白质连接以后，滴加顺磁金属离子，HSQC中部分残基有两个顺磁信号，说明标签和顺磁金属离子配位以后，存在不止一种构象。