[发明专利]肽基核苷类杂合抗生素NikkoxinE和NikkoxinF及其制备方法

权利要求书

1.两种肽基核苷类杂合抗生素的Nikkoxin E和Nikkoxin F，其结构如下所示：

2.权利要求1所述肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F的制备方法，包括以下步骤：

1)重组菌株LSY4的构建

将质粒pJTU5701/ΔnikOΔnikQ通过接合转移导入多氧霉素工业菌株的polOP和polF基因突变株Li3，通过apramycin抗性筛选和PCR验证，得到重组菌株LSY4；所述质粒pJTU5701/ΔnikOΔnikQ是以同框缺失方式将尼克霉素的核苷骨架的生物合成关键基因nikO和4-甲酰-4-咪唑-2-酮生物合成关键基因nikQ都敲除得到的，所述突变株Li3是以同源重组的方式在多氧霉素工业菌株中氨甲酰多聚草氨酸生物合成关键基因polOP和聚肟酸生物合成关键基因polF中插入硫连丝菌素抗性基因而得到的双突变菌株；

2)重组菌株LSY4发酵和肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F提取和纯化

重组菌株LSY4直接进行发酵培养，用草酸将发酵液的pH值调节至3.0，离心过滤后将滤液用阳离子交换树脂吸附Dowex 50Wx8H⁺，用0.1M氨水洗脱，选择性收集组分并旋转蒸发浓缩；用分析型HPLC进行检测，再经制备型HPLC获得杂合抗生素纯品Nikkoxin E和Nikkoxin F。

3.权利要求1所述肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F的制备方法，包括以下步骤：

1)重组菌株LSY4的构建

将质粒pJTU5701/ΔnikOΔnikQ通过接合转移导入多氧霉素工业菌株的polOP和polF基因突变株Li3，通过apramycin抗性筛选和PCR验证，得到重组菌株LSY4；所述质粒pJTU5701/ΔnikOΔnikQ是以同框缺失方式将尼克霉素的核苷骨架的生物合成关键基因nikO和4-甲酰-4-咪唑-2-酮生物合成关键基因nikQ都敲除得到的，所述突变株Li3是以同源重组的方式在多氧霉素工业菌株中氨甲酰多聚草氨酸生物合成关键基因polOP和聚肟酸生物合成关键基因polF中依次插入硫连丝菌素抗性基因而得到的双突变菌株；

2)高产菌株QL4的构建

将nikS通过NdeI和EcoRI酶切位点克隆到载体pJTU968上，再通过MfeI和EcoRI进行双酶切获得含有红霉素启动子的nikS片段，然后再将该片段通过EcoRI酶切位点载体pPM927上获得质粒pPM927/nikS，以接合转移方式将质粒pPM927/nikS转入重组菌株LSY4，通过streptomycin抗性筛选和PCR验证，得到高产菌株QL4；

3)高产菌株QL4发酵和肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F提取和纯化

高产菌株QL4直接进行发酵培养，用草酸将发酵液的pH值调节至3.0，离心过滤后将滤液用阳离子交换树脂吸附Dowex 50Wx8H+，用0.1M氨水洗脱，选择性收集组分并旋转蒸发浓缩；用分析型HPLC进行检测，再经制备型HPLC获得杂合抗生素纯品Nikkoxin E和Nikkoxin F。

4.权利要求1所述的肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F在制备抗真菌药物中的应用。