[发明专利]一种双特异性抗体EGFR×CD3的构建及应用

说明书

本发明提供了一种双特异性抗体，本申请的双特异性抗体由单链单元和单价单元组成，其中该单链单元针对免疫细胞的表面抗原CD3具有特异性结合能力，该单价单元针对肿瘤细胞表面抗原EGFR具有特异性结合能力；该单链单元包含与Fc片段融合的单链可变片段(ScFv)，该单价单元包含轻链和重链对。本申请还提供双特异性抗体的制备方法以及这些抗体的药学用途。

技术领域

本发明涉及免疫学的技术领域。具体地说，涉及双特异性抗体的构建和制备方法。

背景技术

双特异性抗体(bispecific antibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。以下是针对所研究的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，以及相关技术发展的一些背景技术介绍。

1.CD3

CD3分子由4个亚基组成：δ、ε、γ、ζ，其分子质量分别为18.9kDa、23.1kDa、20.5kDa、18.7kDa，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肽链，常与T细胞受体(T cell receptor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体，结构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)，TCR识别并结合由MHC(major histo-compatibility complex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有SH2(Scr homology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM的磷酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。

2.EGFR

表皮生长因子受体(EGFR，Epidermal Growth Factor Receptor)是表皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。EGFR也被称作HER1、ErbB1，突变或过表达一般会引发肿瘤。EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170KDa。EGFR位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，包括EGF和TGFα(transforminggrowth factor α)。激活后，EGFR由单体转化为二聚体，尽管也有证据表明，激活前也存在二聚体。EGFR还可能和ErbB受体家族的其他成员聚合来激活，例如ErbB2/Her2/neu。

在配体与EGFR结合后，受体发生了二聚作用，二聚作用既包括两个同种受体分子的结合(同源性二聚作用)，也包括人类EGF相关性受体(HER)酪氨酸激酶家族中的不同成员的结合(异源性二聚作用)。二聚作用后是酪氨酸残基的自磷酸化作用。这些磷酸化的残基是募集适配蛋白和额外的酪氨酸激酶底物的结合位点。蛋白质在激活的受体复合物中相互作用刺激ras蛋白，导致磷酸化级联反应的发生和丝裂原激活蛋白(MAP)激酶的激活。或者转录信号传导和激活、磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K)-Akt和应激活化蛋白激酶(SAPK)信号传导通路将被激活。这些信号通路依次触发基因转录，同时控制细胞增生、分化和生存的通路被激活。