[发明专利]一种双特异性抗体EGFR×CD3的构建及应用

权利要求书

1.双特异性抗体，其特征在于，所述该抗体包含：(a)单价单元，为轻链-重链对，该轻链-重链对针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，该肿瘤细胞表面抗原是EGFR；和(b)单链单元，为融合肽，该融合肽包含单链可变片段ScFv和具有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力；

其中，单 链单元包括针对人源CD3的抗体抗-CD3，单价单元包括针对EGFR的抗体抗-EGFR；并且

所述抗-EGFR重链的氨基酸序列为序列号1所示的氨基酸序列，抗-EGFR的轻链的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD3ScFv-Fc的氨基酸序列为序列号9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重链在222位点上的半胱氨酸与抗-EGFR的轻链215位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在228和231位点上的半胱氨酸与抗-CD3ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在394和411位点上与抗-CD3ScFv-Fc的428和397位点上形成盐桥连接，所述的抗-EGFR重链在368位点上与抗-CD3ScFv-Fc的436位点上形成隆突-入-穴连接；

或所述抗-EGFR重链的氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列，抗-EGFR的轻链的氨基酸序列为序列号7所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD3ScFv-Fc的氨基酸序列为序列号9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重链在222位点上的半胱氨酸与抗-EGFR的轻链214位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在228和231位点上的半胱氨酸与抗-CD3ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在394和411位点上与抗-CD3ScFv-Fc的428和397位点上形成盐桥连接，所述的抗-EGFR重链在368位点上与抗-CD3ScFv-Fc的436位点上形成隆突-入-穴连接。

2.制备权利要求1所述双特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第二表达载体上，所述第一表达载体是pCHO1.0；所述第二表达载体是pCHO1.0-潮霉素；

(2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清，所述细胞是CHO-S细胞；

(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换缓冲液PBS。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述方法的步骤(1)中：

所述单价单元为抗-EGFR抗体，扩增其轻链所用引物为KozakF，MK-LeaderF，和hIgKR，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为KozakF，MK-LeaderF和hIgG1R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrI I与BstZl7I引入重链；将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-EGFR轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-EGFR的pCHO1.0表达载体，带Erbitux抗体基因的质粒命名为pCHO1.0-ERB-HL-KKW，或者带Vectibix抗体基因的质粒命名为pCHO1.0-VEC-HL-KKW；

所述单链单元为抗-CD3ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为KozakF，L2K-VH(MK)F1和hIgG1R，通过PCR扩增抗CD3ScFv-Fc结构域，并将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的pCHO1.0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗CD3ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为pCHO1.0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY。