[发明专利]磁珠法提取病毒DNA/RNA的试剂盒以及使用方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种磁珠法提取病毒DNA/RNA的试剂及其使用方法。

背景技术

背景技术描述段落分子生物学技术可应用于遗传性疾病的研究和病原体的检测，并将肿瘤的病因学、发病学、诊断和治疗等方面的研究提高到了基因分子水平，核酸的分离与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。 核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离。

目前核酸分离技术虽然发展迅速，但是均存在一些缺点：例如：酚氯仿抽提法虽然核酸纯度高，但是其对人体有害，且容易造成环境污染，同时提取过程需要反复抽提，多次换管，步骤繁琐，会造成样本的丢失与污染。碱裂解法：该法提取的核酸不容易保存，并且不能用于提取RNA。硅胶膜吸附柱法提取的核酸DNA/RNA浓度纯度低、实现自动化困难、单位时间通量低。

磁珠是由四氧化三铁或三氧化二铁等磁性粒子与各种含活性功能基团的二氧化硅材料复合而成的球形微粒，磁珠表面可被赋予多种活性功能基团，如-COOH、-OH等，也可共价结合酶、细胞、抗体等生物活性物质。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，当粒径小于一定值时，磁珠便具有了很好的瞬时磁响应性，也就是超顺磁性，可避免发生中粒子那样的磁性团聚，因为具有超顺磁性，磁珠可在外加磁场的作用下被定为、导向和分离。表面结合的特殊基团以及活性物质可以特异吸附核酸，并在磁场的作用下达到分离核酸的作用。

发明内容

本发明致力于开发一种快速、可自动化的大规模提取核酸方法，并提供一种采用磁珠从样本中提取并纯化核酸的试剂盒。该试剂盒操作简便，提取核酸片段完整、纯度高，适用于检测、克隆、序列分析、PCR扩增、分子杂交和测序等下游实验。

该试剂盒组分如下：提取液Ⅰ（裂解）、提取液Ⅱ（结合）、提取液Ⅲ（洗涤）、提取液Ⅳ（洗涤）、提取液Ⅴ（洗脱）、磁珠悬浮液、蛋白酶K工作液、核酸助沉剂。

所述提取液Ⅰ（裂解）为含表面活性剂的溶液，优选的是2M-5M GuSCN、60-95mM Tris-HCl、0.5%-2% Triton X-100 、20~100mM EDTA，所述提取液Ⅰ的pH值=6-7。

所述提取液Ⅱ（结合）优选的是0.6-3 M NaCl、0.6%-3% β-巯基乙醇、50-200mM HEPES。

所述提取液Ⅲ（洗涤）优选的是50%-65%乙醇、20-200mM NaCl和20-150mM Tris-HCl。

所述提取液Ⅳ（洗涤）优选的是20-200mM Tris-HCl的水溶液。

所述提取液Ⅴ（洗脱）含有10 mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH值=8.0。

所述磁珠悬浮液优选的是磁珠含量为30~60mg/ml，磁珠颗粒直径为0.2-1.5μm。

所述蛋白酶K工作液优选的是终浓度为1-20mg/ml。

所述核酸助沉剂为分子生物学级5-30mg/mlAcryl多聚物溶液。

上述的磁珠法提取病毒核酸的试剂盒提取方法，其包括以下步骤：

1）在生物样本中加入提取液Ⅰ、磁珠、蛋白酶K、提取液Ⅱ，使样本裂解释放出DNA/RNA，DNA/RNA与纳米磁珠结合，在磁场作用下，磁珠聚集，磁珠-核酸复合物和液体分离；

2）向磁珠-核酸复合物加入提取液Ⅲ，洗去复合物表面蛋白质、脂类以及盐离子等杂质，在磁场作用下，得到洗涤后的磁珠-核酸复合物；

3）向磁珠-核酸复合物加入提取液Ⅳ，洗去复合物表面蛋白质、脂类以及盐离子等杂质，在磁场作用下，得到洗涤后的磁珠-核酸复合物；

4）向洗涤后的磁珠-核酸复合物加入提取液Ⅴ，改变磁珠和核酸结合情况，将核酸在磁珠上面洗脱下来，在磁场作用下，磁珠和核酸DNA/RNA溶液分离，得到纯化的核酸DNA/RNA。

本试剂盒试用样本包括血清、血浆、组织提取液、拭子洗液、分泌物、粪便、病毒培养液和其他无细胞体液样本。

本发明所提取的核酸可直接进行PCR及RT-PCR等分子生物学实验研究以及临床检测。

本试剂盒可用配合自动化仪器，高通量提取病毒核酸。

附图说明

图1为采用本发明的试剂盒提取的中检所国家参考品L0-L7扩增结果。

图2为采用本发明的试剂盒提取的HCV不同稀释度扩增结果。

具体实施方式