[发明专利]诱导表达抗菌肽的植物表达载体及其用途

说明书

技术领域

本发明属于柑桔品质改良技术领域，具体涉及诱导表达抗菌肽的植物表达载体及其用途。

背景技术

柑桔溃疡病是一种世界性病害，发生于亚洲的几乎每一个柑桔生产国以及除了地中海国家以外的其它地区。柑桔溃疡病细菌主要危害新叶、嫩枝和未成熟的果实，严重时落叶、枯枝、落果，树势衰弱，产量降低，果实品质变劣，一旦疫情在柑桔主产区传播蔓延，对柑桔产业具有毁灭性、灾难性打击。目前，世界各国尚不能通过药剂或人工摘叶等方式来完全根治柑桔溃疡病害，而只能采取铲除发病植株及其周边一定区域内的柑桔植株等一系列措施，来彻底清除溃疡病菌寄主和根除柑桔溃疡病，为此，对果农来说，经济损失非常严重。

随着植物转基因技术的不断发展，许多柑桔品种的遗传转化技术已被成功建立，于此同时许多功能基因已被成功导入柑桔基因组中，获得了许多性状改良的转基因材料：陈善春等(1996)将柞蚕抗菌肽D基因转化锦橙、新会橙和沙田柚；罗赛男等(2008)用TERF1基因提高了冰糖橙抗溃疡病的能力；Cardoso等(2010)用人抗菌肽基因attacin A转化甜橙并获得了抗柑桔溃疡病的株系；Mendes等(2010)用水稻抗白叶枯病基因Xa21转化4个甜橙品种并获得部分抗溃疡病细菌的株系；Li等(2011)将溃疡病细菌无毒基因PthA的NLS序列导入甜橙中，提高了柑桔抗溃疡病的能力；He等(2011)将抗菌肽Cecropin B和Shiva A双价基因转入锦橙和甜橙中并获得对溃疡病细菌有显著抗性的株系。上述抗性基因的表达策略主要由CaMV 35S组成型启动子控制。抗性基因的组成型表达往往会对植物带来诸如持续激活植物在逆境条件下才合成的蛋白质和代谢产物、打破植物体内激素平衡、连续刺激系统免疫应答反应等不利影响；而且其安全性、专一性和表达效率存在问题。

利用病原物诱导启动子控制抗病基因一直是植物抗病基因工程育种研究的一大热点。该策略具有如下优点：①在无相应的病原微生物浸染时，抗病基因保持沉默，不会对植物造成任何不利影响；②当植物受到病原微生物入侵时，病原物诱导启动子能立即驱动抗病基因在浸染位点表达，植物防卫反应随即启动，有关保护蛋白基因亦被激活，并能迅速有效地抵抗病原微生物的侵害；③抗性基因在病原物诱导启动子控制下，在植物的非侵染部位可以保持沉默，因而能有效避免抗菌蛋白可能带来的食用安全问题(如转基因果实的食用安全)；④因此，相对其它类型启动子，利用病原物诱导启动子调控抗性基因的表达更有利于转基因植物经济有效使用体内物质和能量、提高抗性和产量。

目前，还没有关于利用病原物诱导启动子控制抗菌肽基因提高柑桔抗性的研究报道。可能的原因在于：一、大多数病原物诱导启动子的强度远远低于CaMV 35S等组成型强启动子；二、抗菌肽作为外源小分子肽，在植物细胞内极易被胞内蛋白酶降解而活性大大降低。因此，病原物诱导启动子指导抗菌肽的表达水平往往难于到达杀菌效果，无法有效提高转基因植株的抗性水平。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为改良柑桔溃疡病抗性提供一种新选择。

本发明的技术方案是诱导表达抗菌肽的表达框架，采用柑桔溃疡病病原菌高效诱导表达启动子调控天蚕素抗菌肽的表达。

优选的，所述的天蚕素抗菌肽为植物细胞间隙分泌型天蚕素抗菌肽，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

具体的，所述的启动子为烟草病原物诱导启动子PPP1、马铃薯病原物诱导启动子gst1或烟草病原物诱导启动子hs203J；启动子PPP1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；启动子gst1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

优选的，所述启动子为PPP1。

本发明还提供了还有所述表达框架的植物表达载体。

具体的，采用PPP1启动子的植物表达载体中所包含的T-DNA具有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；采用gst1启动子的植物表达载体中所包含的T-DNA具有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列。

本发明还提供了含有所述植物表达载体的宿主细胞。

优选的，所述宿主细胞为农杆菌。

本发明还提供了所述植物表达载体在改良柑桔溃疡病抗性中的用途。

本发明还提供了所述的宿主细胞在改良柑桔溃疡病抗性中的用途。