[发明专利]一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法:包括以下步骤：

采用套叠PCR获取3-’端增加核定位信号的人巨细胞病毒pp65基因；

将该基因克隆至慢病毒表达载体PLVX-puro中，并包装表达pp65-NLS基因的慢病毒；

用表达pp65-NLS基因的慢病毒感染K562细胞；采用嘌呤霉素筛选出稳定表达pp65-NLS基因的K562细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法,其特征在于:pp65-NLS基因是通过套叠PCR在正常人巨细胞病毒pp65基因3-’端增加核定位信号NLS。

3.根据权利要求2所述的一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法,其特征在于:核定位信号的氨基酸残基序列为DPKKKRKVDPDPKKKRKVDPKRKVGSTGSRGT。

4.根据权利要求1所述一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法,其特征在于:其中pp65基因表达在细胞核中，与人巨细胞病毒感染细胞时pp65蛋白在受感染细胞中的定位一致，而与直接转染pp65基因只会表达在细胞浆中不同。

5.根据权利要求1所述一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法,其特征在于:

制备方法包括以下步骤：

（1）制备3’端连接核定位信号的pp65基因

根据Genebank中已公布的HCMVAD169株基因序列，确定HCMV pp 65基因编码序列，设计用于扩增HCMV pp 65的PCR引物，以HCMV AD169 DNA为模板，通过三轮套叠PCR，获得3’端携带核定位信号的pp65基因，连接至PLVX-Puro质粒，构建重组质粒PLVX-Puro-pp65-NLS，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，通过DNA测序获得序列正确的重组载体；

（2）慢病毒包装

将序列正确的重组载体PLVX-Puro-pp65-NLS质粒与慢病毒包装质粒PSP和ΔG，按2:3:3的比例混合，转染至293FT细胞，48h 后收集细胞培养上清，通过ELISA法检测p24蛋白浓度判定包装好的慢病毒液滴度，根据测定的慢病毒滴度，如果滴度未达到10⁷PFU/ml,则通过超速离心将慢病毒浓缩至滴度达10⁷PFU/ml以上;

（3）、慢病毒感染及抗性细胞筛选

将慢病毒液按MOI=10感染K562细胞，用含2μg/ml嘌呤霉素的完全培养基持续培养7日，筛选出具有嘌呤霉素抗性的细胞；

（4）、克隆化培养

将具有嘌呤霉素抗性的K562细胞通过有限稀释培养法培养，从而获得单个细胞形成的克隆，挑取单个克隆扩大培养，并用间接免疫荧光观察，选择细胞核内表达pp65的细胞。

6.一种如权利要求1所述核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的应用,其特征在于:其可用做人巨细胞病毒抗原血症检测的阳性对照品。