[发明专利]一种低分子量硫酸软骨素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及硫酸软骨素，尤其是涉及一种低分子量硫酸软骨素的制备方法。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，简称CS)是来自动物软骨组织的一类天然的酸性粘多糖，其糖链由交替的二糖单位(N-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖)组成并连接在核心蛋白上。研究显示，硫酸软骨素在治疗关节损伤、角膜损伤、神经痛以及消炎抗菌等方面有重要作用，同时具有促进冠状动脉循环、降血脂、抗凝血、抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性，已被广泛应用于药品、保健食品以及化妆品行业的原料。

我国是世界上最重要的鲟鱼生产大国，养殖产量占世界85％以上。鲟鱼通体为软骨，其头骨、脊索骨以及鳍骨约占鱼体的10％，可充分利用制备硫酸软骨素。目前，国内提取硫酸软骨素使用较多的方法是稀碱或浓碱与酶结合的方法。其中，碱解能有效打断CS与核心蛋白连接的O型糖肽键，提高得率，然而，完全碱解(以软骨完全溶解为终点)一般需要3～5h甚至更长时间，这样易导致硫酸软骨素二糖结构单元的破坏，影响产品质量和活性。

高分子量的硫酸软骨素，由于其表观黏度高、结构复杂以及细胞膜的选择通透性等因素，造成了其生物利用率低，口服吸收差及疗效不稳定，而低分子量硫酸软骨素(低分子量硫酸软骨素)具有生物利用度高和活性强等功能特性，越来越受到人们的重视。可以预见，低分子量硫酸软骨素产品的市场需求将逐年剧增。然而，现有生产技术均先由动物软骨得到CS成品，再经过降解得到低分子量硫酸软骨素产品，或直接购买市售CS原料制备低分子量硫酸软骨素产品。其工艺需要重复进行纯化、沉淀、干燥等操作，工序繁杂且成本高。另外，国内硫酸软骨素降解工艺研究较少，常见的降解方法有酶法、酸法、过氧化氢法等，但均有其不完善的地方。公开号为CN101659973A和CN103602711A的中国专利申请均涉及低分子硫酸软骨素的制备方法，虽然酶法具有环境污染小、反应条件温和、产品纯度高等优点，但降解CS的酶特异性高、价格昂贵，来源稀少，不适合大规模生产。公开号为CN1940082A的中国专利申请披露了一种盐酸降解制备低分子量硫酸软骨素的方法，其生产周期长，产品纯度不高；公开号为CN1995071A的中国专利申请涉及一种低分子量硫酸软骨素的制备方法，然而，过氧化氢法降解机制尚不完全清楚，2011年国家食品添加剂使用标准(GB2760-2011)已取消过氧化氢作为助剂在食品加工中的使用，其安全性有待进一步考证。公开号为CN103554304A的中国专利申请涉及一种用鲟鱼软骨制备低分子量鲟鱼硫酸软骨素的方法，虽然辐射结合超微粉碎降解硫酸软骨素简便易行、无污染，但是其先得到大分子量硫酸软骨素，再降解得到低分子量硫酸软骨素产品的工艺步骤繁杂，生产周期长，设备要求高，产品分子量分布较宽。至今，安全可靠、具有产业化潜力、生产成本较低的低分子量硫酸软骨素制备工艺尚未出现。

发明内容

本发明的目的在于提供以鲟鱼软骨为原料，能同步进行硫酸软骨素的提取和降解，减少生产步骤，防止低分子量硫酸软骨素生产过程中的分解，提高产品的纯度和收率，步骤简单，工艺稳定，产品质量高，生产周期短，生产成本低，适合工业化生产的一种低分子量硫酸软骨素的制备方法。

本发明包括以下步骤：

1)软骨预处理：将鲟鱼煮沸去除肌肉、脂肪等表面附着物，用石油醚浸泡后，用乙醇冲洗，烘干、粉碎得软骨颗粒；

2)碱预处理：在软骨颗粒加入NaOH溶液，第一次搅拌后，用酸调节pH至中性，得软骨母液；

3)酸和酶处理：在软骨母液中先加入苹果酸，调节pH至3.0～3.2，再加入胃蛋白酶，第二次搅拌，调节pH至5.0～5.5，然后加入木瓜蛋白酶和纤维素酶，第三次搅拌后，加入活性炭，第四次搅拌，过滤得澄清酶解液；

4)过柱纯化：将步骤3)所得酶解液经树脂吸附，用NaCl溶液梯度洗脱，利用间苯三酚分光光度法检测，合并收集具有显色反应的洗脱液；

5)沉淀干燥：将洗脱液用乙醇沉淀，离心收集沉淀，干燥后，即得低分子量硫酸软骨素晶体。

在步骤1)中，所述用石油醚浸泡的时间可为8～12h，优选10h。

在步骤2)中，所述颗软骨粒与NaOH溶液按料液比可为1︰(4～6)，优选1︰5，所述NaOH溶液可采用质量百分浓度为4％～6％的NaOH溶液；所述第一次搅拌的条件可于45～50℃恒温搅拌30～45min；所述酸可采用盐酸，所述盐酸的质量百分浓度可为10％～30％。