[发明专利]一种朱砂叶螨细胞色素p450基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫生理和生物技术领域，尤其涉及一条朱砂叶螨细胞色素P450基因及其用于转基因抗螨棉创制的应用。

背景技术

朱砂叶螨别名棉红蜘蛛、棉叶螨、红叶螨，在世界各地均有分布，在我国华北、华东、华中、华南、东北等地区均有发生。该螨是一种多食性的农业害螨，主要危害棉花、豆类、茄科类以及玉米等多种作物。朱砂叶螨个体非常小，肉眼很难发现；具有极强的繁殖能力，在适宜的生长环境下产卵量多；世代周期短，在短时间内就能迅速形成一定数量的种群。朱砂叶螨主要在植物叶背及叶脉两侧聚集，以口针刺吸植株汁液，并结成丝网，使受害叶片逐渐褪绿，形成无数白色斑点，对植物组织造成严重的伤害。在田间，朱砂叶螨危害严重时可导致植株叶片完全干枯脱落，甚至成片死亡，造成严重的经济损失。多年来对朱砂叶螨最有效的防治方法就是使用化学药剂。至上世纪八十年代末，朱砂叶螨至少对25种杀虫、杀螨剂(有机氯、有机磷、有机氮类以及拟除虫菊酯类的多种农药)产生了抗药性。朱砂叶螨抗性的产生使得对其防治变得更加困难。

棉花是最重要的天然纤维作物，我国是世界上最大的原棉生产和消费国。虫害是影响棉花优质高产的关键因素之一。我国每年因虫害造成的棉花产量损失约为10％－15％，全国每年用于棉花害虫防治的杀虫剂用量约占杀虫剂使用总量的2/3。1997年，来自美国的转基因抗虫Bt棉开始在我国推广种植，Bt棉很好地控制了棉铃虫的危害，使棉花的农药使用量降低约65％。吴孔明等(2008)分析了中国北方六省1992年到2007年间中国棉铃虫的种群情况，发现随着Bt棉的种植，棉铃虫的种群数量有显着降低。随着Bt棉在我国大面积的推广种植，一些次生性的害虫如棉叶螨，棉蚜等种群数量逐年上升，逐步成为棉花种植过程中的重要害虫。

朱砂叶螨作为棉花的重要害虫，对其科学高效的防治显得十分的重要。朱砂叶螨传统的化学防治方法存在许多的问题，如农药“3R”问题。对于朱砂叶螨的防治迫切需要新的防治策略，比如挖掘和鉴定抗螨的基因并通过植物介导的RNA干扰技术来进行植物新材料创制和朱砂叶螨生物防治。植物介导的RNA干扰技术作为农作物抗虫基因的工程热点之一，通过在寄主植物中表达目标害虫特异基因的双链RNA(dsRNA)，害虫取食植物以后沉默其对应的重要基因从而达到控制害虫危害的目的。

细胞色素P450还原酶作为叶螨体内的一类重要的超家族解毒代谢酶，该类基因对朱砂叶螨体内有毒物质的解毒代谢起到非常大的作用。棉酚是棉花产生的重要的次生代谢物，一方面，对于叶螨或昆虫来说棉酚是一类有毒的外源物质，叶螨或昆虫取食棉酚以后取食能力，生存力和繁殖力降低，生长受到抑制，严重的甚至死亡；另一方面，叶螨和昆虫能够依靠自身的解毒代谢酶系将棉酚代谢为无毒物质，从而成功为害棉花。

发明内容

本发明的目的是提供一种朱砂叶螨细胞色素p450基因，其cDNA碱基序列包括SEQ ID NO.1所示的序列，所述序列是编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列。

本发明还保护与该基因相关的重组表达载体，转基因细胞系，重组菌和表达盒。重组表达载体，转基因细胞系，重组菌和表达盒可用于朱砂叶螨防治中的应用：1、防治叶螨，2、防治叶螨相关的产品，3、抑制朱砂叶螨的产卵量，4、干扰朱砂叶螨的发育历期，5、抑制朱砂叶螨体内细胞色素P450基因的表达。

本发明通过对朱砂叶螨取食豇豆苗和棉苗不同寄主植物后进行数字基因表达谱测序，根据同时满足表达差异倍数大于6倍、表达丰度超过15和具有解毒和消化功能的标准进行筛选,获得了一条适应朱砂叶螨取食棉花的重要细胞色素P450基因(tcCYP1)。朱砂叶螨取食棉花苗后该基因(tcCYP1)上调倍数超过8倍，并且表达丰度(RPKM)超过16。通过表达谱测序获得tcCYP1基因的超量表达，说明该基因对于朱砂叶螨取食适应棉花植株十分重要。

本发明通过克隆测序获得了细胞色素P450基因(tcCYP1)的全长序列，并利用植物介导RNAi技术将该基因的dsRNA导入棉花植株体内培育抗螨棉。

本发明保护所述的细胞色素P450基因对应的dsRNA序列，其包括SEQ ID NO.3所示的序列全长或片段序列。

本发明还保护所述的细胞色素P450基因、其对应的氨基酸序列及其dsRNA序列在在朱砂叶螨防治中的应用。可用于转基因植株的培育，或用于制备防治朱砂叶螨产品。其中，所述转基因植株优选为转基因棉。

所述dsRNA直接通过饲喂或其他方式导入朱砂叶螨体内，使其产卵量下降，发育历期受到影响，生殖不利。