[发明专利]基于核酸适配体的比色法检测17β-雌二醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于水体中17β-雌二醇的检测领域，涉及一种基于核酸适配体的比色法检测17β-雌二醇的方法，尤其涉及核酸适配体、阳离子聚合物和纳米共同作用的比色法检测17β-雌二醇的方法。

背景技术

17β-雌二醇是一种天然存在的类固醇类激素，并且是人体中具有较强雌激素活性的一种雌激素。它是由人体内的类固醇合成，对于女性的性别特征的形成和维持具有十分重要的作用。同时17β-雌二醇也是一种典型的环境内分泌干扰物，暴露实验结果表明即使水体中低浓度17β-雌二醇也能够扰乱鱼的内分泌系统使得雄鱼趋于雌性化。17β-雌二醇可以通过人类和动物的代谢或者雌激素类药物生产产生的污水等途径进入到环境，间接或者直接的方式危害生殖系统的形态和功能，导致免疫缺陷，从而破坏神经-内分泌-免疫系统网络，从而威胁着水生生物以及人类的健康与安全。

传统的17β-雌二醇的检测方法有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用等方法，虽然这些方法早已发展成熟以及检测结果准确可靠，但是在实际操作过程中需要对样品进行复杂的前处理，如萃取、浓缩和衍生化等，同时这些方法在实际应用中需要昂贵复杂的仪器设备以及训练有素的技术人员，费力费时，难以满足大规模应用及实时实地检测的需要。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是克服传统的大型仪器的检测雌二醇需要对样品进行复杂的前处理以及需要专业人员进行操作等的缺点和不足，提供一种基于核酸适配体的比色法检测17β-雌二醇的方法，具体为一种基于核酸适配体、纳米金和阳离子聚合物的比色法检测水中内分泌干扰物17β-雌二醇的方法。由于核酸适配体能够与靶标17β-雌二醇和阳离子聚合物分别形成17β-雌二醇-核酸适配体复合物和核酸适配体-阳离子聚合物的超分子结构，从而引起纳米金颗粒发生不同程度的聚集导致的颜色变化。体系的颜色和比色信号的变化与加入的17β-雌二醇的量具有一定的线性关系。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种比色法检测17β-雌二醇的标准体系的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一、标准溶液和对照溶液的制备：向含有核酸适配体的缓冲液中加入17β-雌二醇溶液，配置浓度已知的17β-雌二醇浓度梯度溶液，混匀，孵育，得标准溶液；以含有核酸适配体的缓冲液中加入水为对照溶液；

步骤二、阳离子聚合物的加入：向上述标准溶液和对照溶液中加入阳离子聚合物溶液，混匀，孵育；

步骤三、纳米金溶液的加入：向上述加入阳离子聚合物后的标准溶液和对照溶液中加入纳米金溶液，混匀，孵育，即得比色法检测17β-雌二醇的标准体系。

优选地，步骤一中，所述标准液含15个浓度梯度；所述浓度梯度的范围为1～600μM。

优选地，步骤一中，所述标准溶液由17β-雌二醇母液配制，所述母液的配制为：称取0.2724g 17β-雌二醇溶于5mL无水乙醇中，即得。

优选地，步骤一中，所述孵育的条件为25℃、30分钟。

优选地，步骤一中，所述水为超纯水。

优选地，步骤一中，所述缓冲液的配置方法具体如下：称取0.5232g丙磺酸溶于超纯水中，定容至100mL，调节pH＝7。

优选地，步骤二中，所述阳离子聚合物包括聚二烯基丙二甲基氯化铵(PDDA)，为市售试剂；所述阳离子聚合物溶液的浓度为101nM。

优选地，步骤二中，所述孵育的条件为25℃、20分钟。

优选地，步骤三中，所述纳米金溶液的制备方法包括：将10.5mL 1.0wt％柠檬酸三纳加入到100mL煮沸的0.03wt％氯金酸溶液中，不断加热搅拌至溶液由灰色变为酒红色，继续煮沸5分钟；停止加热并冷却到室温，0.2μm超滤膜过滤，即得纳米金溶液；纳米金溶液置于4℃温度下保存待用。

优选地，步骤三中，所述孵育的条件为25℃、5分钟。

第二方面，本发明涉及基于所述标准体系的比色法检测17β-雌二醇的方法，所述方法包括如下步骤：

绘制标准曲线：制备所述17β-雌二醇标准体系，记录其中标准溶液和对照溶液在650nm和520nm波长条件下的吸光度值，以标准溶液与对照溶液对应的相对吸光度的比值之差ΔA作图，绘制标准曲线；

17β-雌二醇样品检测：向含有核酸适配体的缓冲液中加入待测样品，混匀，孵育，同时以加入水的处理为对照溶液；加入阳离子聚合物溶液，混匀，孵育；加入纳米金溶液，混匀，孵育；