[发明专利]使用非热等离子体经皮递送DNA疫苗

说明书

相关申请

本申请要求于2013年12月4日提交的美国临时申请序列号61/911,536，题目为 “TRANSDERMALDELIVERYOFDNAVACCINESUSINGNON-THERMALPLASMA”的优先权和权 益，该申请以其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明大体上涉及DNA疫苗的递送，更具体而言，涉及使用非热等离子体(冷等离 子体)递送DNA疫苗来进行DNA疫苗穿过皮肤、组织或肿瘤的细胞间递送和/或促进DNA疫苗 的细胞内摄取。组织是指身体的上皮组织、粘膜组织、结缔组织和肌肉组织。

背景技术

疫苗是现代医学最重要的发现之一，并且是医生能够提供给患者的最有益的治 疗。然而许多疫苗可预防的疾病等待引起适当的预防性或治疗性免疫反应的技术。大多数 疫苗引起抗体反应，然而，细胞介导的免疫反应(包括CD8T细胞)对于预防、控制或治疗细胞 内细菌、真菌和病毒疾病以及慢性病(包括糖尿病、癌症等)和致死性疾病(如埃博拉病毒 (Ebola))是必要的。

DNA疫苗接种是有利的，因为它不整合到宿主DNA中，具有生产成本效益，并容易储 存，其可以对组织和/或细胞类型具有高度特异性，并且可以同时接种多个制剂(agents)。 皮肤是DNA疫苗接种的理想靶点，因为其具有较大的表面积并存在特化用于诱导免疫的抗 原递呈细胞，如郎格罕氏(Langerhans’s)细胞和真皮树突状细胞。

DNA疫苗可以引起细胞介导的免疫反应和抗体反应。因此，DNA疫苗代表其他疫苗 接种方式的一种有吸引力的替代方式。DNA疫苗由质粒(DNA环)组成，该质粒包含引起保护 所必需的免疫原性蛋白质的基因，加强免疫反应的蛋白质的基因，和在哺乳动物细胞中转 录成RNA，翻译成蛋白质，以及扩增细菌而非哺乳动物细胞中的质粒所必需的DNA序列。对 DNA疫苗的免疫反应类似于对病毒感染的反应，但是更加安全，因为DNA不会传播或引起疾 病。DNA也相对容易生产，并且对环境蛋白酶和核酸酶稳定。DNA疫苗可以用于生成对预防或 治疗疾病(举例来说，如HSV、AIDS、丙型肝炎、癌症、埃博拉病毒以及由于使用更传统方式而 错过了疫苗开发的疾病)所必需的免疫反应。

接受DNA疫苗用于预防性或治疗性疫苗接种的障碍是促进有效递送和细胞摄取以 及适当的细胞介导的免疫反应方面的难处。因为低表达或缺乏免疫识别，单独质粒DNA的注 射对于预防性疫苗接种不会引起足够强的免疫反应。对一些递送和摄取DNA疫苗的方法包 括脂质介导的递送、喷射注射、基因枪和声致穿孔(sonoporation)都进行过测试，但未获得 多少成功。

关于DNA疫苗的遗传学和使用电穿孔体内递送DNA疫苗的最新进展已经提高了表 达效率至可实践的水平。电穿孔使用脉冲电流打开细胞膜中的孔(被称为透化的过程)，并 且允许皮内注射的DNA被皮肤细胞和居留在皮肤中的免疫细胞摄取。电穿孔需要DNA注射进 皮肤或者肌肉中，电极直接接触皮肤或者将电极插入到肌肉中，以及施加直流电流以促进 DNA的细胞摄取。

电穿孔作为药物递送方法具有一些缺点，包括疼痛，应用时肌肉收缩，而且还导致 电流诱发的组织损伤。这些缺点限制了它的普遍采用。的确，与电穿孔相关的疼痛太强烈， 医生或保健师不太可能推荐给小孩或老人使用。另外，电穿孔只能在约5mm²到约7mm²之间的 面积上使用。

南佛罗里达大学的RichardJConnolly的一项研究，题目是PlasmaMediated MolecularDelivery，表明非热等离子体也可以向皮肤递送脉冲电场，并证明这种方法可 以安全地促进皮内注射的DNA疫苗的细胞摄取。实验通过皮内注射体积为50μl的100μg JRFLgp120质粒。该推注(bolus)暴露于正极性或负极性等离子体10分钟。和电穿孔一样，这 种方法要求用针将DNA注射到皮肤中，一种引起疼痛并导致产生必须谨慎处理的生物危险 废弃物的施用方法。而且，所提出的这种方法涉及使用昂贵的稀有气体如氦气来生成等离 子体。